摘要
采用小鼠自由饮用葡聚糖硫酸钠诱导急性溃疡性结肠炎模型，并给予XTF进行干预，使用H-E染色法观察结肠组织病理学变化，运用试剂盒使用方法检测小鼠血清中MPO与结肠组织中IL-1β、TNF-α的含量；基于系统生物学方法阐明XTF治疗溃疡性结肠炎的作用机制。
XTF能够有效改善溃疡性结肠炎炎症，改善溃疡性结肠炎引起的结肠长度缩短，显著降低溃疡性结肠炎小鼠血清中MPO水平以及结肠组织中的IL-1β、TNF-α水平。系统生物学研究显示XTF活性成分可通过AKT1、TNF、IL6、STAT3、SRC等靶点发挥抗UC活性。
溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）主要病灶位于结直肠黏膜及其下层等部位，具有便血、腹泻、体重下降等主要临床特征，同时伴有贫血、关节病、结节性红斑等肠外病
藏药、蒙药、维药、傣药、苗药、壮药等众多民族药作为中国传统医药的重要组成，在防治肠道、肝、胆及心血管疾病等疑难杂症中具有独特的优
泻停封胶囊（批号20231002）由贵州百灵企业集团制药股份有限公司提供。DSS（分子量为36000～50000）购自美国MP Biomedicals 公司（批号YD08001）；柳氮磺吡啶肠溶片购自上海信谊天平药业有限公司（批号09231206）；4%多聚甲醛组织固定液购自兰杰柯科技有限公司（批号23305737）；IL-1β试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司（批号M240311-001a）；TNF-α试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司（批号M240311-102a）；髓过氧化物酶（MPO）测试盒购自南京建成生物工程研究所（批号20240302）；便隐血（OB）试剂购自珠海贝索生物技术有限公司（批号B240101）。
Centrifuge 5430R台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；CP214型万分之一电子分析天平（上海奥豪斯仪器有限公司）；DY89-II型匀浆机（新芝生物科技股份有限公司）；Multiskan Go1510全波长酶标仪（美国 Thermo Fisher 公司）。
XTF低、中、高剂量样品分别为称取XTF去囊壳内容物1.092 g、2.184 g、4.368 g于42 mL生理盐水中溶解。阳性药物组样品为称取1.260 g研磨后的柳氮磺吡啶肠溶片于42 mL生理盐水中溶解。上述样品置于4 ℃冰箱保存。
将适应性喂养后的60只小鼠进行随机分组，除正常组外，其余小鼠均自由饮用3% DSS溶液，持续10 d，以此作为UC模型的构建方法。在此期间如果小鼠出现体重降低、腹泻和便血等症状，说明UC模型构建成功。
实验小鼠适应性饲养7 d后，分为正常组（简称为“Normal”）、阳性药物组（简称为“SASP”）、模型组（简称为“Model”）、XTF低剂量组（简称为“XTF-L”）、XTF中剂量组（简称为“XTF-M”）、XTF高剂量组（简称为“XTF-H”）。根据60 kg成年人每日服药剂量计算小鼠每日给药剂量后得出，XTF-L、XTF-M、XTF-H给予XTF样品的剂量分别为0.39 g·k
在实验过程中，观察小鼠的毛发光泽度及其日常活动情况，每日收集小鼠粪便样本，使用便隐血（OB）检测试剂进行分析，系统记录各实验组别的隐血评估分数、体重变化趋势及粪便物理性状。根据实验周期内小鼠每日体重计算体重下降比率，计算公式为：体重下降比率=（每日体重-初始体重）/初始体重×100%；依据
| 评分 | 粪便性状 | 隐血情况 | 体重下降比率/% |
|---|---|---|---|
| 0 | 正常 | 正常 | 0 |
| 1 | 稀便（+） | 隐血阳性（+） | 1~5 |
| 2 | 稀便（++） | 隐血阳性（++） | 5~10 |
| 3 | 稀便（+++） | 隐血阳性（+++） | 10~15 |
| 4 | 水泻样 | 肉眼便血 | >15 |
末次给药后，实验小鼠禁食不禁水12 h；使用3%浓度的戊巴比妥钠溶液麻醉后，眼眶取血并在4 ℃条件下以3500 r·mi
以OB≥30%、DL≥0.18为基本条件，通过 TCMSP数据库及文献检索，建立XTF成分库。通过Swiss ADME平台进一步筛选得到XTF活性成分，通过PubChem数据库查询活性成分的SMILES，将之导入Swiss Target Prediction数据库进行靶点预测。选择物种为人源，在Uniprot蛋白质数据库对靶点进行规范整理，得到化合物靶
以“ulcerative colitis”为关键词，选择物种为人源，通过GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET数据库检索UC疾病靶点，合并、去重，得到UC疾病靶
通过Venny在线平台获取化合物抗UC靶点；将之导入STRING数据库，进行PPI分析，并应用Cytoscape3.10 软件，通过betweeness、closeness和degree值筛选核心靶点；根据degree值对核心靶点进行排序并通过Cytoscape3.10 软件调整靶点形状、大小、颜色，构建PPI网络
应用DAVID数据库对核心靶点进行GO和KEGG分析；选取GO分析前10条最为显著的条目作GO分析柱状图，以直观展示各分类功能的富集水平；另选取前20条KEGG信号通路绘制成气泡图，通过气泡大小和颜色深浅展示通路的富集程度。
将所获得的XTF活性成分与核心靶点及KEGG分析显示的关键信号通路导入Cytoscape3.10软件，构建XTF-成分-核心靶点-通路图。
在实验过程中，正常组小鼠精神状态佳且活动较频繁，对外界刺激反应迅速，其毛发乌黑亮丽，饮水饮食正常，体重稳步增加，排泄物呈现黄褐色且松软成型。相较于正常组的生理状态，造模后的模型组小鼠整体状况显著恶化，反应迟缓，毛发粗糙暗淡，食欲减退，体重显著下降（P<0.0001），并且出现了严重的腹泻、便血情况，结肠长度明显缩短（P<0.0001）。与模型组的恶化情况相比，SASP及XTF-L、XTF-M、XTF-H在接受干预10 d后，整体状况明显变好，食欲有所好转，腹泻及便血症状减轻，体重下降趋势得到有效控制（除XTF-L外，P<0.01或P<0.05），结肠长度缩短得到显著抑制（P<0.0001或P<0.01），这表明XTF-L、XTF-M、XTF-H对UC小鼠具有明显的治疗作用。见
A. 各组小鼠结肠情况
B. 模型组小鼠肛周状态
C. 各组小鼠平均体重变化情况
D. 各组小鼠平均结肠长度；正常组与模型组相比
图1 6组小鼠体重平均值变化及结肠长度平均值
相较于正常组，模型组小鼠的DAI评分显著升高（P<0.0001）；与模型组相比，XTF-H能够降低UC小鼠DAI评分，具有显著差异（P<0.05）。见
图2 各组小鼠DAI评分情况
正常组与模型组相比
正常组无炎症细胞浸润，结肠组织结构正常；模型组出现显著的病理变化，可观察到大量黏膜上皮细胞溃疡甚至变性坏死，坏死区域杯状细胞几乎完全消失，并有大量炎症细胞浸润以及淋巴结产生。与模型组比较，SASP及XTF-L、XTF-M、XTF-H炎症细胞浸润减少，结肠组织黏膜上皮细胞排列较规则，组织黏膜层杯状细胞数量丰富。见
图3 各组小鼠结肠组织病理切片观察（H-E染色，低倍×40；高倍×100）
黑色箭头：炎症浸润；蓝色箭头：淋巴结；黄色箭头：黏膜上皮细胞溃疡变性坏死
相较于正常组小鼠，模型组血清中MPO的表达呈显著性提升（P<0.001），同时模型组结肠组织中IL-1β、TNF-α的表达水平也呈显著性提升（P<0.0001，P<0.01）。与模型组相比，SASP及XTF-M、XTF-H可显著降低MPO的表达（P<0.001，P<0.01，P<0.05），而XTF-L在降低MPO表达方面与模型组间无统计学差异（P>0.05）；与模型组相比，SASP及XTF-L、XTF-M、XTF-H均能有效降低IL-1β、TNF-α的表达（P<0.0001或P<0.001或P<0.01）。见
图4 XTF对UC小鼠MPO及IL-1β、TNF-α水平的影响
A.血清MPO水平；B.结肠组织IL-1β水平；C.结肠组织TNF-α水平；与正常组相比
根据“1.2.2.1”方法检索得出XTF的药效成分共189个，筛选得到XTF活性成分共63个，通过Swiss Target Prediction数据库预测并去重后得到药物靶点824个。
在 GeneCards、OMIM、DisGeNET、TTD等数据库得到6838个UC相关靶点，经过全面筛选并去重后得到5695个UC靶点。
根据“1.2.2.2”方法得到445个共同作用靶点，由 Cytoscape3.10软件进行筛选及可视化分析，结果见
图5 XTF抗UC靶点分析
A.交集靶点；B.交集靶点PPI；C.核心靶点PPI
根据“1.2.2.3”方法对XTF抗UC的79个核心靶点进行GO与KEGG分析，并构建“XTF-成分-核心靶点-通路”图。
GO分析显示，生物过程（BP）方面主要涉及细胞凋亡过程的负调控、蛋白质磷酸化的调控、信号传导等过程；细胞成分（CC）方面主要包括细胞质、细胞核及胞浆等区域；分子功能（MF）方面主要包括蛋白质结合、酶结合以及蛋白激酶结合等功能。见
KEGG分析显示，PI3K-Akt、AGE-RAGE、Ras、MAPK等信号通路与炎症及免疫调节密切相关，提示其是XTF潜在的抗UC信号通路。见
“XTF-成分-核心靶点-通路”图显示，XTF的63个主要活性成分可能通过调控AKT1、TNF、IL6、STAT3、SRC等79个核心靶点，通过PI3K-Akt、AGE-RAGE、Ras与MAPK等20条信号通路发挥抗UC作用。见
A. GO柱状图
B. KEGG气泡图
C. “XTF-成分-核心靶点-通路”图（KS：苦参；JGL：金果榄；DY：地榆；GLM：功劳木）
图6 GO与KEGG分析及XTF-成分-核心靶点-通路图
溃疡性结肠炎是人类炎症性肠病中不容忽视的疾病之一，严重危害患者身心健康。藏、蒙、维、傣、壮、苗等民族药是中国传统医药的重要组成部分，在在防治肠道、肝、胆及心血管疾病等疑难杂症中往往具有独特的优
DSS诱导UC小鼠模型稳定可靠，与患者的临床特征基本一致，在抗UC活性与作用机制研究中广泛应
系统生物学可研究基因调控网络、细胞信号传导、生物系统组成三者之间相互关系的结构与功
另一方面，系统生物学核心靶点研究结果显示，XTF抗UC的核心靶点分别为AKT1、TNF、IL6、STAT3以及SRC。大量研究表明，AKT参与调控细胞生长、增殖、细胞周期和糖代
总之，本研究将DSS诱导小鼠UC模型结合系统生物学方法，首次阐明了苗药复方泻停封胶囊抗UC活性与作用机制，为其后续产业化发展与临床应用提供了一定参考依据。
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