摘要
采用随机数字表法，将28只雄性SPF级4 w龄的Wistar大鼠分为空白组6只和造模组22只。造模组大鼠每日交换饮用0.1%氨水溶液或20 mmol/L脱氧胆酸钠溶液，配合饥饱失常法，每日1 h夹尾，每周1次30%乙醇和2%水杨酸钠的混合液灌胃，共干预18 w进行造模。随机处死4只模型组大鼠用于模型评价。造模成功后，采用随机数字表法将剩余的18只大鼠分为模型组、替普瑞酮组、加味柴芍六君汤组，每组各6只。空白组与模型组按10 mL/kg以灭菌饮用水灌胃，替普瑞酮组按15 mg/kg以替普瑞酮混悬液灌胃，加味柴芍六君汤组按6.9 g/kg以加味柴芍六君汤灌胃，每日1次，共干预4 w。观测大鼠一般行为学表现及体质量，利用光镜观察大鼠胃黏膜组织的病理学变化，借助酶联免疫吸附法（ELISA）测定大鼠血清中炎症因子IL-8、IL-1β、TNF-α含量，采用定量聚合酶链式反应（q-PCR）法测定大鼠胃黏膜组织E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的mRNA表达情况。
相较于模型组，替普瑞酮组及加味柴芍六君汤组大鼠的一般情况均改善，体质量升高（P<0.05）；大鼠上皮层柱状细胞无脱落，固有层腺体萎缩明显改善，数量增多，排列较整齐，形态较规则，炎细胞浸润减少，主细胞和壁细胞增加；血清IL-8、IL-1β、TNF-α含量均显著降低（P<0.001，P<0.05）；胃黏膜组织E-cadherin mRNA表达升高，N-cadherin、Vimentin mRNA表达水平降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。
慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是指胃黏膜反复损害，固有层腺体减少，伴或不伴肠腺化生和（或）假幽门腺化生的一种慢性消化系统疾病，其主要症状为上腹部疼痛、胀闷
中医药在改善CAG相关症状、阻断或逆转胃黏膜萎缩进程、预防癌变等方面具有独特优
28只雄性、4 w龄的SPF级Wistar大鼠，体质量（120±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物生产许可证号为SCXK（沪）2022-0004，合格证编号为20220004004144，饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室，标准饲料喂养。本实验经福建中医药大学动物伦理委员会批准（伦理编号：FJTCMIACUC2022143）。
加味柴芍六君汤药物组成：北柴胡6 g，白芍4.5 g，人参9 g，白术9 g，茯苓9 g，炙甘草3 g，陈皮6 g，姜半夏4.5 g，丹参9 g，莪术9 g。饮片购自闽侯县上街镇致诚药店，经福建中医药大学甘慧娟教授鉴定为合格的中药饮片。上述10味中药以蒸馏水浸泡30 min，纯水煎煮2次，并将煎煮后的药液混合均匀，用三层无菌纱布对药液进行3次过滤，将药液浓缩至含生药量6.9 g/kg的中药汤剂。制备好的汤剂分装后放置于4 ℃冰箱保存备用。
替普瑞酮胶囊，由卫材（中国）药业有限公司生产，批号为2212040。实验前用蒸馏水将其配成浓度为15
mg/kg的替普瑞酮混悬液，现配现用。
脱氧胆酸钠（北京奥博星生物技术有限公司，批号：20200915）；氨水（西陇科学股份有限公司，批号：202001021）；水杨酸钠（阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：S104176）；无水乙醇（西陇科学股份有限公司，批号：19060102）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号：N25HR202423）；IL-1β、IL-8、TNF-α ELISA试剂盒（上海酶联有限公司，批号分别为E23029632、E23024523、E23024523）；逆转录试剂（湖南艾科瑞生物工程有限公司，批号：A4A2739）；qPCR反应试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，批号：A4A1959）。
采用随机数字表法将大鼠随机分为空白组6只，造模组22只，用大鼠耳标钳标记编号。适应性喂养1 w后，空白组给予常规饮食，不做干预。造模组则构建肝郁脾虚型CAG大鼠模
造模成功后，采用随机数字表法将造模组剩余的18只大鼠分为模型组、替普瑞酮组、加味柴芍六君汤组，各6只。空白组与模型组：标准饲料进食，每日1次按10 mL/kg以灭菌饮用水灌胃；替普瑞酮组：标准饲料进食，每日1次按15 mg/kg以替普瑞酮混悬液灌胃；加味柴芍六君汤组：标准饲料进食，每日1次按6.9 g/kg以加味柴芍六君汤灌胃。每组均干预4 w。给药剂量参照人和动物剂量常规换算
实验结束后，予12 h禁食不禁水，随后给予腹腔注射20%乌拉坦，待大鼠完全麻醉后，固定其肢体，并通过腹主动脉采集血样。采得的血样在室温条件下静置2 h后进行离心处理。分装上清液至新标记的离心管中，-80 ℃冰箱冻存备用。将大鼠断头处死后，取出全胃，修剪胃周边多余脂肪组织，由幽门至胃大弯将胃黏膜剪开，并使用冰生理盐水冲洗胃内容物。胃窦部于4%多聚甲醛试管中固定24 h后流水冲洗6 h，浸泡于75%乙醇溶液于4 ℃储存。胃体部位于-80 ℃冰箱冻存备用。
将固定好的胃黏膜组织取出，修剪成0.5 cm×0.5 cm大小后放入包埋盒，通过80%、90%、95%和100%的乙醇梯度脱水，使组织逐渐失去水分；然后利用二甲苯处理至胃黏膜呈半透明状；在62 ℃环境下进行浸蜡和包埋处理，切片厚度为4 μm，烤片，脱蜡；HE染色后再次进行脱水处理和二甲苯透明化；最后使用中性树脂进行湿封，并通过常规光学显微镜（×400）观察胃黏膜组织的病理学改变。
取出血清置于碎冰解冻后，根据酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒说明书，配置所需标准品和样品，对大鼠血清炎症因子白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量进行测定。
采用定量聚合酶链式反应（q-PCR）法测定各组大鼠胃黏膜组织E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的mRNA表达情况。将胃黏膜组织从冰箱中取出，解冻后进行研磨，按照说明书提取RNA，测量浓度并将样品逆转录成cDNA，反应参数：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃。然后将反应液、基因引物、cDNA在冰上配制成20 μL的qPCR反应体系：2X Premix（ROX）10 μL、上下游引物各0.8 μL、RNase free water 6.4 μL、cDNA 2 μL。在荧光定量PCR仪进行qPCR反应，反应参数：95 ℃、30 s，1个循环；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40个循环。通过溶解曲线判断引物合成是否准确，根据有无双峰判断是否存在污染等，将数据导出分析得出各样本及内参的CT值。引物由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成，引物序列见
| 基因 | 引物序列（5’to 3’） | 产物长度/bp |
|---|---|---|
| E-cadherin | F：GAG CCA GAC ACA TTC ATG GAA CA | 108 |
| R：CTC AGC CCG AGT GGA AAT GAC | ||
| N-cadherin | F：AGG CTT CTG GTG AAC TTG CAT | 176 |
| R：ATC CAC CTT GAA ATC TGC TGG T | ||
| Vimentin | F：AGA TGC TCC AGA GGG AGG AA | 84 |
| R：GGT CAA GAC GTG CCA GAG AA | ||
| β-actin | F：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG | 150 |
| R：ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA |
空白组大鼠毛发光滑洁白，活泼跳跃，便质正常，气味淡；模型组大鼠毛色黯淡枯黄，安静蛰伏，神情倦怠，便质较软，色偏黄，味臭；替普瑞酮组大鼠毛发蓬松，毛色柔和，活泼，便质转硬，气味稍臭；加味柴芍六君汤组大鼠毛发柔软、毛色微黄，活泼机敏，精神饱满，便质硬，色褐，味淡。
造模前，空白组与造模组大鼠体质量比较，无统计学差异（P>0.05）。造模后，造模组大鼠体质量较空白组显著减轻（P<0.001），见
| 组别 | 造模前 | 造模后 |
|---|---|---|
| 空白组 | 171.55±11.84 | 423.55±4.58 |
| 造模组 | 166.19±9.85 |
295.34±11.8 |
注： 与空白组比较
连续干预4
w后，与空白组比较，模型组大鼠的体质量下降（P<0.001）。与模型组比较，加味柴芍六君汤组大鼠的体质量显著增加（P<0.05）。见
| 组别 | n | 体质量/g |
|---|---|---|
| 空白组 | 6 | 441.03±7.47 |
| 模型组 | 6 |
290.38±6.8 |
| 替普瑞酮组 | 6 | 327.70±5.63 |
| 加味柴芍六君汤组 | 6 |
347.60±26.2 |
注： 与空白组比较
空白组大鼠固有层腺体形态规则，排列整齐紧密；模型组大鼠上皮层柱状细胞脱落，固有层内腺体萎缩，数量减少，大小不一致，排列疏松紊乱（黑色箭头所示），有炎细胞浸润（红色箭头所示），主细胞和壁细胞减少（黄色箭头所示）；干预后，替普瑞酮组和加味柴芍六君汤组大鼠上皮层柱状细胞无脱落，固有层腺体萎缩明显改善，数量增多，排列较整齐，形态较规则，炎细胞浸润减少，主细胞和壁细胞较模型组增加。见
A. 空白组
B. 模型组
C. 替普瑞酮组
D. 加味柴芍六君汤组
图1 各组大鼠胃黏膜组织HE染色病理图（×400）
与空白组比较，模型组大鼠血清IL-8、IL-1β、TNF-α含量显著升高（P<0.001）；与模型组比较，加味柴芍六君汤组与替普瑞酮组大鼠血清IL-8、IL-1β、TNF-α含量均显著降低（P<0.001，P<0.05）。见
| 组别 | n | IL-8 | IL-1β | TNF-α |
|---|---|---|---|---|
| 空白组 | 6 | 13.40±2.67 | 9.70±1.17 | 14.42±2.13 |
| 模型组 | 6 |
32.55±2.4 |
27.54±1.9 |
25.20±1.9 |
| 替普瑞酮组 | 6 |
19.74±1.8 |
14.91±2.1 |
21.68±1.7 |
| 加味柴芍六君汤组 | 6 |
15.67±2.5 |
10.83±1.3 |
13.11±1.5 |
注： 与空白组比较
与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织E-cadherin mRNA表达减少（P<0.05），N-cadherin、Vimentin mRNA表达水平升高（P<0.001）；与模型组比较，加味柴芍六君汤组和替普瑞酮组大鼠胃黏膜组织E-cadherin mRNA表达升高，N-cadherin、Vimentin mRNA表达水平降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。见
| 组别 | n | E-cadherin | N-cadherin | Vimentin |
|---|---|---|---|---|
| 空白组 | 6 | 1.10±0.52 | 1.17±0.55 | 1.04±0.33 |
| 模型组 | 6 |
0.16±0.1 |
6.31±1.0 |
5.28±0.8 |
| 替普瑞酮组 | 6 |
0.55±0.1 |
3.10±1.3 |
2.63±0.3 |
| 加味柴芍六君汤组 | 6 |
0.67±0.1 |
4.15±1.1 |
2.14±0.5 |
注： 与空白组比较
CAG作为一种常见的慢性消化系统疾病，归属于中医学“胃脘痛”“嗳气”“胃痞”等范畴。该病病位主要在胃、脾、肝，表现出虚实夹杂、寒热错杂的病理特征。肝郁、脾虚以及血瘀是其主要病理特
柴芍六君汤出自《医宗金鉴》，方含人参、白术、茯苓、甘草、柴胡、白芍、陈皮、半夏，是临床上治疗CAG的常用方
EMT是指上皮细胞转变为间质细胞的过程，主要表现为细胞失去极性，形状改变，产生侵袭、迁移的能
炎症因子是介导炎症反应的重要介质，对CAG的发生、发展起重要作
本研究结果表明，模型组大鼠IL-8、IL-1β、TNF-α含量升高，上皮标记物E-cadherin表达下调，间质标记物N-cadherin、Vimentin表达上调，结合大鼠一般情况和病理结果表现，说明CAG模型大鼠胃黏膜炎症反应明显，EMT发生。加味柴芍六君汤治疗后，大鼠血清IL-8、IL-1β、TNF-α含量明显低于模型组；胃黏膜组织中上皮标记物E-cadherin含量较模型组上调，间质标记物N-cadherin、Vimentin含量较模型组下调，且大鼠一般情况和病理表现均有改善，说明加味柴芍六君汤治疗后CAG大鼠炎症反应显著改善，EMT过程受到抑制。
综上所述，加味柴芍六君汤能够显著修复CAG大鼠胃黏膜损伤，其作用机制可能是通过抑制炎症因子IL-1β、IL-8、TNF-α的表达，进而上调上皮标记物E-cadherin，下调间质标记物N-cadherin、Vimentin，调控EMT过程，从而改善胃黏膜病变，修复CAG胃黏膜损伤。
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