摘要
将21只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为空白组（6只）与造模组（15只），采用复合造模法构建PLGC模型，处死3只验证模型成功后，造模组随机分为模型组（n=6）和CGM组（n=6）。CGM组给予复方胃炎合剂原液灌胃，空白组及模型组给予生理盐水灌胃，共灌胃30 d。末次给药12 h后，取胃组织，进行转录组测序；实时反转录聚合酶链反应 （RT-PCR）进一步验证CGM对PLGC大鼠胃组织脂肪因子（Adiponectin、Leptin）和炎症因子（TNF-α、IL-6） mRNA表达水平的影响。
通过对转录组数据进行分析发现，PLGC与Adipocytokine信号通路、Thyroid hormone信号途径、糖酵解/糖异生途径以及特定类型癌症相关的途径关系异常密切；RT-PCR结果表明模型组与CGM组中的Adiponectin、Leptin、TNF-α和IL-6的mRNA表达水平存在显著差异，并且CGM能显著降低这四种因子的mRNA表达水平（P<0.05或P<0.01）。
关键词
胃癌（gastric cancer，GC）是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，特别是在我国，其高发病率和高致死率对人类健康和生命造成严重威胁，所带来的负担亦尤为沉重，2022年胃癌新发病例约为50.9万，死亡人数约为40万，居全球首
本课题组在国医大师杨春波教授指导下，对PLGC进行了系列研究：结合中医证候学调查，认为PLGC证候多以脾胃气虚为本，痰、湿、热、瘀为
SPF级wistar雄性大鼠21只，体质量（110±10） g，购自上海莱斯克实验动物有限公司，动物许可证编号：SYXK（闽） 2020-0002。所有大鼠饲养于福建中医药大学SPF级动物实验中心，12/12 h昼夜交替，环境温度（23±2） ℃，湿度（55%±5%）。研究已通过福建中医药大学动物实验伦理委员会审批，批准号2W2023036。
①复方胃炎合剂的制备来源于福建中医药大学附属第二人民医院药剂室。具体药物如下：炙黄芪150 g，党参100 g，炒白术100 g，茯苓150 g，枳壳60 g，白芍100 g，法半夏100 g，砂仁45 g，佩兰100 g，黄连30 g，陈皮60 g，地龙干150 g，莪术60 g，甘草30 g。药液制备方法：加水（药物的8倍量）浸泡0.5 h，煎煮3次，第1次、第2次、第3次的煎煮时长分别为1.5 h、1 h、0.5 h，最后合并3次煎液，过滤药渣。将滤液置于60～70℃下减压浓缩至500 mL，以含生药2.67 g/mL为最终所取药液浓度，灭菌分装后置于4 ℃冰箱保存备用。②盐酸雷尼替丁胶囊，0.15 g/片，赛诺菲（杭州）制药有限公司生产，批准文号：国药准字H33021741。
根据课题组既往造模方案进行模型分组与构
完成大鼠模型构建后，采用随机数字法将验证后的12只PLGC模型大鼠分为模型组、复方胃炎合剂组（CGM组），每组各6只。CGM的成人临床每日用量为：炙黄芪15 g，党参10 g，炒白术10 g，茯苓15 g，枳壳6 g，白芍10 g，法半夏10 g，砂仁4.5 g，佩兰10 g，黄连3 g，陈皮6 g，地龙干15 g，莪术6 g，甘草3 g。根据药物剂量等效换算，CGM组给予复方胃炎合剂原液灌胃，给药剂量为13.35 g/（kg·d），用生理盐水稀释至4 mL；空白组及模型组给予4 mL生理盐水灌胃。各组均每日灌胃1次，共30 d。
在本研究项目中，先采用核糖体RNA去除试剂盒从总RNA中除去rRNA，进而使用离子打断技术将RNA断裂为长度约300 bp的片段。选择此长度是因为接头长度是预设的；若片段过短，将导致接头序列在测序数据中占比过高，降低数据的有效性；若片段过长，则不利于测序过程中簇的形成。随后，采用六碱基随机引物和逆转录酶，以RNA为模板合成cDNA第一链，继而以此为模板合成第二链cDNA。文库构建完毕后，通过聚合酶链反应（PCR）扩增文库片段，并依据片段大小筛选，优选长度为450 bp的文库片段。利用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库质量进行严格检验，并测定文库的总浓度及有效浓度。基于文库的有效浓度及所需数据量，将带有不同Index序列的文库按比例混合，便于在测序数据输出后根据Index区分不同样本。混合文库随后被均一化稀释至2 nM，并进行碱变性处理，形成单链文库以供测序使用。在完成样品的RNA抽提、纯化及文库构建等一系列预处理步骤后，本研究采用基于Illumina HiSeq平台的第二代测序技术，对文库进行双末端测序分析。测序由北京奥维森科技有限公司协助完成。
在进行原始数据质量控制时，首先去除含有接头序列和低质量碱基部分，以得到用于转录组分析的高质量序列。随后，使用 HISAT2 软件将过滤后的高质量序列与大鼠参考基因组进行比对，而后用 RSEM 软件对基因表达水平进行定量分析，以准确地估计基因的转录本丰度。采用R语言ggplots2软件包绘制差异表达基因的火山图，使用R语言Pheatmap软件包对CGM组差异表达基因的并集和样品进行双向聚类分析。最后，利用 Metascape 网站对筛选出的核心基因进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，所采用的检验方法为 Fisher 精确检验。
实时荧光定量 RT-PCR 检测基因表达根据总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，采用Nanodrop 2000 超微量分光光度计检测RNA纯度，采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 进行反转录实验予合成cDNA模板。在 96孔板中加入1 μL的cDNA和19 μL的Real-time PCR 反应液（10 μL的2×SYBR Green qPCR Master Mix，1 μL前引物，1 μL后引物，7 μL的DEPC水），置于PCR仪扩增，反应条件为:95 ℃，30 s预变性；95 ℃变性15s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。GAPDH 作为内参校正，通过
| 基因 | 正向序列（5’-3’） | 反向序列（5’-3’） | 产物长度 |
|---|---|---|---|
| Adiponectin | CGCAGGTGTTCTTGGTCCTA | GTTGTCCCCTTCCCCATACA | 454 bp |
| Leptin | GACACCCTTAGAGGGGGCTA | AACCCAAGCCCCTTTGTTCA | 402 bp |
| TNF-α | ATCCGAGATGTGGAACTGGC | AAATGGCAAATCGGCTGACG | 472 bp |
| IL-6 | CCACCCACAACAGACCAGTA | GTCTTGGTCCTTAGCCACTCC | 451 bp |
| GAPDH | GACTCTACCCACGGCAAGTT | GATGGCATGGACTGTGGTCA | 396 bp |
采用转录组学技术对模型组与CGM组的胃组织基因表达差异进行了分析。在筛选标准Fold Change≥2，P<0.01下，发现两组之间共有1090个DEGs。与模型组相比，CGM组中有424个基因明显上调，666个基因明显下调。这些结果通过火山图（见
A. 火山图（该图中每个点代表一个基因。红色点表示显著上调的基因，绿色点表示显著下调的基因，黑色点表示表达没有显著变化的基因。x轴测量基因表达倍数变化的对数，y轴显示p值的负对数，突出提示统计学意义）
B. 分级聚类热图（该图提示两组之间基因表达的层次聚类。热图中的每个矩形对应于基因的表达水平：红色表示显著上调，绿色表示显著下调。这些矩形的排列显示了跨组基因表达的聚类模式）
图1 CGM组与模型组间胃组织差异表达基因的火山图与分级聚类热图
对经过CGM干预的PLGC大鼠出现的DEGs进行GO功能富集分析后发现，在细胞组分（CC）类别中，这些基因与线粒体、呼吸链、细胞膜这些组分的关联最为密切；在分子功能（MF）方面，转运蛋白活性、跨膜转运蛋白活性、底物特异性转运活性、底物特异性的跨膜转运活性、氧化还原酶活性、ATP酶活性等的富集度最为显著；在生物过程（BP）方面，这些基因主要与细胞内部或细胞之间特定分子或结构的位置调节、小分子代谢过程、跨膜转运、氧化磷酸化、糖酵解过程等过程密切相关（见
A. 模型组与CGM组之间DEGs的功能类别分析
B. 生物过程GO富集分析的气泡图
图2 胃组织差异表达基因的GO富集分析
对经过CGM干预的PLGC大鼠出现的DEGs进行KEGG通路富集分析后发现，遗传信息处理的人类疾病中的癌症通路、癌症中的转录失调，以及生物学途径类别中的脂肪细胞因子信号通路和甲状腺激素信号通路在PLGC的发生、发展中占据重要作用（见
A. 模型组与CGM组中DEGs的KEGG通路分类比较分析
B. 气泡图描绘的前20个显著富集的途径
图3 胃组织差异表达基因的KEGG通路富集分析
基于上述转录组学结果，进一步验证Adipocytokines在CGM组的表达差异。Adipocytokines参与了许多重要的生理过程，常见的Adipocytokines包括脂联素（Adiponectin）、瘦素（Leptin）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）。采用RT-PCR检测以上四种Adipocytokines，结果如
| 组别 | Adiponectin | Leptin | TNF-α | IL-6 |
|---|---|---|---|---|
| 空白组 | 1.005±0.146 | 1.066±0.132 | 0.942±0.102 | 0.976±0.156 |
| 模型组 |
1.442±0.18 |
2.689±0.25 |
2.201±0.13 |
4.077±0.61 |
| CGM组 |
1.202±0.12 |
1.458±0.18 |
1.247±0.14 |
1.310±0.38 |
注： 与空白组比较
本研究结合既往研究结果，探索CGM对PLGC大鼠模型胃黏膜病变的影响及其潜在机制。研究结果显示，CGM干预后的大鼠模型在多个与炎症和肿瘤发展相关的基因表达上发生了显著变化，这些变化可能反映了其潜在的治疗作用。考虑到CGM的多成分特性，这一结果可能反映了多种活性成分的协同作用，这与中药复方疗法的整体观和多靶点疗法的理念一致。然而，复合药物治疗的确切分子机制往往难以界定，需要进一步的研究去鉴定那些具有药理活性的特定成分，并揭示其如何共同作用于复杂的生物网络。
胃组织DEGs的GO富集分析以及KEGG通路富集分析结果表明，CGM可能通过影响多个生物学过程和代谢通路发挥作用，如与线粒体功能、呼吸链、跨膜转运蛋白活性、氧化还原酶活性相关的基因的表达变化。特别是Adipocytokine信号通路的显著富集，可能反映了CGM对于代谢调节和炎症反应的调控作用。这方面的研究尚缺乏，但与现有文献中对脂肪细胞因子在酒精性胃炎中作用的描述是一致
RT-PCR结果进一步验证了CGM能显著降低PLGC大鼠炎症相关因子Adiponectin、Leptin、TNF-α、IL-6的mRNA表达水平，这强调了其作为一种潜在的抗炎疗法的价值。不过，值得注意的是，虽然Adiponectin通常被视为具有抗炎作用的脂联
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