摘要
通过小鼠急性毒性实验观察三黄汤及其萃取部位对钩吻中毒小鼠的解毒作用，采用UPLC-MS分析三黄汤以及三黄汤石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇萃取部位及萃余水对钩吻中钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙几种生物碱成分溶出的影响。
三黄汤、三黄汤萃取部位可延长钩吻中毒后小鼠的存活时间，降低动物死亡率，并且对钩吻生物碱的溶出具有一定的影响，其中对毒性主要成分钩吻素己的溶出具有抑制作用，而对活性成分钩吻素子等降低作用较弱或无明显降低作用。
钩吻 Gelsemium elegans （Gardn. et Champ.）Benth. （GE）为马钱科胡蔓藤属植物，具有较强的毒性。现代研
本课题组前期从多个方面开展钩吻减毒存效研究，包括炮制减
H-class型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）、ACQUITY QDa型质谱仪（美国Waters公司）、GT-2120QTS型超声波清洗机（广东固特超声股份有限公司）、AR223CN型千分之一电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]、ME204E型万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、DLSB-5/20B型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）、RE100-S型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）、TDL-40B型离心机（上海安亭科学仪器厂）、Milli-Q型超纯水仪（美国 Millipore 公司）。
胡蔓藤碱乙对照品（批号：BBP02653，纯度≥95%）、胡蔓藤碱丙对照品（批号：BBP02553，纯度≥97.5%）均购自云南西力生物科技有限公司；钩吻素己对照品（批号：MUST-14100901，纯度≥96%）、钩吻素甲对照品（批号：MUST-15071312，纯度≥98%）、钩吻素子对照品（批号：MUST-15062614，纯度≥99%）均购自成都曼思特生物科技开发有限公司；钩吻绿碱对照品（批号：P15A10S85857，纯度≥95%）购自上海源叶生物科技有限公司；水为超纯水；甲醇、甲酸为色谱纯；石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯。
钩吻药材购自云南文山；大黄（批号：210201）、甘草（批号：210901）均购自北京本草方源（亳州）药业科技有限公司；黄芩（批号：21121104）、栀子（批号：21051004）均购自安国市一方药业有限公司。经福建中医药大学黄泽豪教授鉴定，钩吻为马钱科胡蔓藤属植物钩吻Gelsemium elegans （Gardn. et Champ.）Benth.的干燥茎；大黄为蓼科植物掌叶大黄 Rheum palmatum L.的干燥根及根茎；黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根；甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎；栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。
（1）GE生物碱的制备：称取150 g钩吻粉末，用10倍量的95%乙醇回流提取3次，每次2 h，抽滤，旋转蒸发浓缩至0.15 g/mL，浓缩液用二氯甲烷萃取至无色，浓缩至膏状，冻干至粉末状密封置于-20 ℃保存备用（得率为2.05%）。（2）SHD醇提液的制备：取大黄粉末9 g、黄芩粉末6 g、甘草粉末3 g、栀子粉末20 g，用50%的乙醇浸泡30 min，超声提取2次，提取溶剂体积分别为10倍、8倍，每次0.5 h，抽滤并收集提取液，旋转蒸发浓缩至无醇味，定容得到SHD醇提液（生药浓度为0.76 g/mL），4 ℃冷藏备用。（3）SHD萃取部位的制备：取2剂SHD（单剂剂量：大黄9 g、黄芩6 g、甘草3 g、栀子20 g），用50%的乙醇浸泡30 min，超声提取2次，提取溶剂体积分别为10倍、8倍，每次0.5 h，抽滤，旋转蒸发至无醇味，定容至50 mL（含生药浓度：1.52 g/mL），加入95%乙醇醇沉（最终乙醇浓度为80%），4℃、12 h，3500 r/min离心，10 min后浓缩至干，定容至100 mL，再依次用与SHD醇提液等量的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取3～5次，萃取至无色后，各部位（含萃余水部位）萃取液旋转蒸发浓缩并定容至10 mL，4 ℃冷藏备用。
取小鼠16只，随机分成4组，每组4只，禁食16～18 h，自由饮水。按0.1 mL/10 g，20 g/kg、15 g/kg、10 g/kg、5 g/kg的剂量分别给小鼠灌服GE，观察小鼠24 h内的中毒症状和死亡情况并记录，确定引起动物全部死亡的最低剂量。
将64只小鼠随机分成8组：空白组（Control组）、钩吻组（GE组）、先灌服钩吻后灌服SHD醇提液组（GE-SHD组，灌服两种药液的时间间隔为3 min，下同），先灌服钩吻后灌服SHD石油醚部位组（GE-SHD石油醚部位组）、先灌服钩吻后灌服SHD三氯甲烷部位组（GE-SHD三氯甲烷部位组）、先灌服钩吻后灌服SHD乙酸乙酯部位组（GE-SHD乙酸乙酯部位组）、先灌服钩吻后灌服SHD正丁醇部位组（GE-SHD正丁醇部位组）、先灌服钩吻后灌服SHD水部位组（GE-SHD水部位组），每组8只，实验前禁食不禁水12 h，各组小鼠按计算所得的剂量进行一次性灌胃给药，每只小鼠按0.1 mL/10 g给药，观察并记录小鼠14 d内的中毒症状和死亡情况。
色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH-C18（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～0.5 min，12% A；0.5～8 min，12%～20% A；8～11 min，20% A；11～17 min，20%～30% A；17～22 min，30%～40% A；22～28 min，40%～70% A；28～30 min，70% A；30～31 min，70%～12% A；31～33 min，12%～12% A）；进样量：10 µL；检测波长：254 nm；柱温：40 ℃；流速：0.25 mL/min。
检测器：Waters QDA质谱检测器；离子源：电喷雾离子源（Electrospray Ionization Source，ESI）；扫描方式：正离子SIR扫描；正离子模式毛细管电压：0.8 kV；锥孔电压：25 V；采样速率：10点/s；扫描质量范围：100～1000 Da。钩吻中6种生物碱的分子量见
| 成分 | 分子式 | 分子量（Da） |
|---|---|---|
| 钩吻素子（Koumine） | C20H23N2O | 307.17 |
| 钩吻碱甲（Gelsemine） | C20H23N2O2 | 323.17 |
| 钩吻素己（Gelsenicine） | C19H22N2O3 | 327.17 |
| 钩吻绿碱（Gelsevirine） | C21H25N2O3 | 353.10 |
| 胡蔓藤碱丙（Humantendine） | C21H27N2O3 | 355.11 |
| 胡蔓藤碱乙（Humantenine） | C19H23N2O4 | 343.00 |
精密称定适量的钩吻绿碱、钩吻素子、胡蔓藤碱丙、胡蔓藤碱乙、钩吻素己、钩吻素甲对照品，加入甲醇，充分溶解，定容至10 mL，得对照品母液。甲醇稀释，得到钩吻绿碱、钩吻素子、胡蔓藤碱丙、胡蔓藤碱乙、钩吻素己、钩吻素甲的浓度分别为9.45、93.00、38.48、33.25、23.20、24.00 µg/mL的混合对照品贮备液。
以下所述的药材粉末均过100目筛。（1）GE供试品溶液制备：精密称取钩吻粉末1.000 g，加入50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）20 mL，混匀，超声提取30 min（220 V，50 Hz，下同），在3500 r/min下离心10 min，再取1 mL加50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）4 mL，过0.22 μm滤膜，平行测定3份样品。（2）SHD与GE配伍溶液制备：精密称取钩吻粉末1.000 g、大黄粉末0.900 g、黄芩粉末0.600 g、甘草粉末0.300 g、栀子粉末2.000 g，将以上药材粉末加入50 mL离心管中，加入50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）20 mL混匀，称定重量，之后超声提取30 min，取出放冷，再次称重，补足失重，3500 r/min离心10 min，取1 mL加50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）4 mL，过0.22 μm滤膜。（3）SHD萃取部位与GE配伍溶液制备：取2剂的SHD药物粉末（单剂剂量：大黄9 g、黄芩6 g、甘草3 g、栀子20 g），用10倍量的50%乙醇溶液（含0.1%甲酸）浸泡30 min，超声提取2次，每次0.5 h，抽滤，旋转蒸发至无醇味，定容至50 mL（含生药浓度：1.52 g/mL），加入95%乙醇醇沉（最终乙醇浓度为80%），于4 ℃静置12 h，后以3500 r/min离心10 min，上清浓缩至干，定容至100 mL，再依次用与SHD醇提液等量的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水进行萃取，萃取至有机层无色后，旋转蒸发浓缩并定容至10 mL，取各萃取部位1 mL，用100%甲醇1 mL进行稀释，再加入50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）18 mL以及钩吻粉末0.200 g，混匀，超声提取30 min，3500 r/min离心10 min，过0.22 μm滤膜，平行测定3份样品。
按“2.3”项下条件制备供试品溶液，采用上述条件进行UPLC-MS检测，记录峰面积，然后按标准曲线分别计算钩吻素子、钩吻素甲、钩吻素己、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙及钩吻绿碱含量。
经GE不同剂量给药后，小鼠出现痉挛、惊厥、跳跃，最后呼吸衰竭而导致死亡，死亡时间均在给药后0.5 h内。当GE剂量≥10 mg/kg时，小鼠死亡率均为100%，故确定GE的最低致死剂量为10 mg/kg。见
| GE剂量（mg/kg） | n | 小鼠存活率（%） |
|---|---|---|
| 20 | 4 | 0 |
| 15 | 4 | 0 |
| 10 | 4 | 0 |
| 5 | 4 | 50 |
予10 mg/kg的GE时小鼠全部死亡，但GE配伍SHD、SHD三氯甲烷部位、SHD乙酸乙酯部位、SHD正丁醇部位、SHD水部位后，小鼠死亡率均显著下降，其中SHD乙酸乙酯部位能显著降低GE毒性且存活率达100%；GE配伍SHD、SHD三氯甲烷部位、SHD正丁醇部位、SHD水部位存活率分别为：87.5%、75%、75%、50%，且小鼠死亡时间显著延长；GE配伍SHD石油醚部位其存活率无显著变化，但亦能延长死亡小鼠的存活时间。见
| 组别 | n | GE剂量（mg/kg） | 存活率（%） | 存活时间（s） |
|---|---|---|---|---|
| Control组 | 8 | - | 100 | - |
| GE组 | 8 | 10 | 0 | 749.12±45.22 |
| GE-SHD组 | 8 | 10 | 87.5 | 715.50 |
| GE-SHD石油醚部位组 | 8 | 10 | 0 |
1164.00±180.2 |
| GE-SHD三氯甲烷部位组 | 8 | 10 | 75 |
1481.00±22.6 |
| GE-SHD乙酸乙酯部位组 | 8 | 10 | 100 | - |
| GE-SHD正丁醇部位组 | 8 | 10 | 75 |
1755.00±38.1 |
| GE-SHD水部位组 | 8 | 10 | 50 |
949.00±44.9 |
注： 与GE组比
UPLC-MS检测结果显示，与单纯的GE溶液对比，GE与SHD配伍后钩吻素子、钩吻碱甲、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、胡蔓藤碱丙的溶出量均呈下降趋势，具有统计学差异（P<0.01或P<0.001）。见
图1 SHD对GE中6种生物碱成分溶出的影响
与GE组相比
UPLC-MS检测结果显示，SHD萃取部位对GE中6种生物碱成分均有影响，其中，与单纯的GE溶液对比，GE与SHD乙酸乙酯部位配伍后钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙、钩吻素己的溶出量均有较为明显降低趋势，具有统计学差异（P<0.001）。见
图2 SHD萃取部位对GE中6种生物碱成分溶出的影响
与GE相比
钩吻是福建省特色药材，因其毒性而闻名，但具有潜在的抗炎、镇痛、抗肿瘤药用价值，具有“止痛不成瘾”的优
《伤寒论》记载：“病皆与方相应者，乃服之。”中医理论经过实践不断丰富发展，逐渐形成“方证相关”理论，即方药与病证存在高度关联性与对应性，体现中医“辨证论治”和整体观念的诊疗特点。三黄汤药简力宏，《千金方衍义》曰：“此于伊尹三黄汤中以栀子、甘草之轻剂易去黄连之苦寒，使速分利阴阳，不致重味侵犯中州也。”方中栀子泻火泄热而除烦，清三焦之热，与甘草合用可清中焦之热，顾护脾胃；大黄泻下攻积，凉血解毒，逐瘀通经；黄芩清热燥湿。四药合用，共奏凉血祛瘀、通腑泄热之效。
钩吻所致中毒症
本研究通过先灌服钩吻后灌服三黄汤进行钩吻中毒小鼠解毒实验，观察三黄汤对钩吻急性毒性的影响：经钩吻不同剂量给药后，以小鼠死亡率100%确定钩吻的最低致死剂量为10 mg/kg；根据小鼠存活率及死亡时间，综合得出三黄汤解救钩吻急性中毒的药效强弱表现为：三黄汤乙酸乙酯部位>三黄汤>三黄汤三氯甲烷部位、三黄汤正丁醇部位>三黄汤水部位>三黄汤石油醚部位，其中三黄汤乙酸乙酯部位能显著降低钩吻毒性且小鼠存活率达100%。以上结果表明，三黄汤对钩吻确有减毒作用，其主要减毒物质可能为三黄汤乙酸乙酯部位，但是其中化学成分的具体变化仍不清楚。
为了进一步阐明三黄汤对钩吻减毒的物质基础，本研究通过UPLC-MS检测钩吻生物碱成分变化，发现经过三黄汤及其萃取部位作用后，会影响钩吻生物碱溶出，表现为降低或者部分升高，其中对毒性主要成分钩吻素己的溶出具有抑制作用，而对活性成分钩吻素子等降低作用较弱或无明显降低作用，表明钩吻与三黄汤及其萃取部位配伍后可降低毒性而保存药效，同时提示钩吻与三黄汤及三黄汤萃取部位配伍后发生了化学变化，但具体涉及哪些环节则在本研究中未能明晰，仍需进一步深入研究。
综上所述，本实验从钩吻中毒表现出的热证出发，运用“方证相关”理论，观察三黄汤及其萃取部位对钩吻生物碱成分溶出及毒性的影响，结果表明“方证相关”理论指导的《千金要方》三黄汤能降低钩吻中毒小鼠死亡率、延长存活时间，其中乙酸乙酯部位效果最佳，且通过观察生物碱成分溶出量可知三黄汤及其萃取部位对钩吻具有减毒存效的作用，因此未来可围绕三黄汤乙酸乙酯部位减毒物质基础及存效作用开展深入研究，以促进钩吻的临床安全应用。本研究进一步丰富了“方证相关”减毒理论的内涵，亦为钩吻减毒存效研究提供一定参考，在一定程度上为钩吻在临床上的安全应用提供实验基础。
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