摘要
随机将30只大鼠分为对照组、模型组、益肾降糖饮低剂量组、益肾降糖饮高剂量组、达格列净组，以柠檬酸缓冲液溶解的1%链脲佐菌素（STZ）经腹腔注射建立DKD大鼠实验模型。经8 w治疗后，检测并比较各实验组大鼠禁食状态下的血糖、24 h尿蛋白、肾组织病理的变化，以及转化生长因子-β1（TGF-β1）/SMAD2/3信号通路、纤维粘连蛋白（FN）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况。
与模型组比较，益肾降糖饮低剂量组、益肾降糖饮高剂量组大鼠的肾重指数、空腹血糖、 24 h尿蛋白、TGF-β1、SMAD2/3、纤维粘连蛋白（FN）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达及肾纤维化程度均明显降低（P<0.05或P<0.01）。
全球糖尿病患者发病率逐年攀升，预计2045年将影响近8亿
30只雄性SD大鼠，均为SPF级，周龄为6～8 w，体质量150～170 g，购于南通大学，在南京中医药大学附属医院实验动物中心饲养，环境温度25～26 ℃，湿度50％～65％，采用人工照明，12 h光明与12 h黑暗规律交替。动物饲养与实验流程均符合动物伦理学相关原则，伦理审查批件号：2021DW-06-01，实验动物许可证编号：SCXK（鲁）2019 0003。所有大鼠均可自由饮水和进食。
益肾降糖饮（药物组成：制何首乌、生地黄、当归、玄参、生黄芪、太子参、山药、肉苁蓉、赤芍、马齿苋、炒苍术、制僵蚕、黄芩以及新鲜的石橄榄）为福建中医药大学附属人民医院院内制剂，闽药制字 Z06010605，用蒸馏水配制成所需浓度，于4 ℃冰箱存放备用；达格列净片（国药准字J20170040，阿斯利康制药有限公司）；链脲佐菌素（streptozocin，STZ，货号s0130，美国Sigma公司）。
一抗FN、二抗辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗兔、一抗α-SMA和二抗HRP标记山羊抗小鼠（Servicebio），柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1 mmol/L，pH 4.5，飞净生物科技有限公司），大鼠总蛋白检测试剂盒（雷杜生命科学有限公司），环保型脱蜡透明液、柠檬酸（pH 6.0）抗原修复液、磷酸盐（phosphate buffered saline，PBS）缓冲液、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染液、马松（Masson）染液、分化液和返蓝液（Servicebio）。
根据随机数字表将30只大鼠随机分为对照组6只和造模组24只，对照组大鼠予普通饲料饲养，造模组所有大鼠均以高脂高糖饲料（普通饲料77.7%，精炼猪油10.0%，胆固醇2.0%，猪胆盐0.3%，蔗糖10.0%）进行喂养。第5 w末予禁食 12 h后，所有大鼠均用乙醚浅麻醉，造模组予腹腔注射柠檬酸缓冲液溶解的1% STZ建立DKD大鼠模型，造模组大鼠STZ给药剂量定为35 mg/k
YSJT-L、YSJT-H给药剂量分别为12.6 g·k
所有大鼠在治疗前、治疗第4 w末及第8 w实验结束时，利用代谢笼收集大鼠24 h的尿液，记录尿量，并将尿标本离心后待检。在第8 w给药结束后，让大鼠禁食12 h，准确测量体重，用3%戊巴比妥钠（按照0.2 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠后迅速打开腹腔，游离摘取双侧肾脏，剔除肾周筋膜，称取肾脏重量后沿中线切开，再用无菌生理盐水冲洗，部分切面平整的肾组织持续24 h于4%多聚甲醛溶液中进行固定处理，以备制作病理切片，部分置于-80 ℃冰箱中备用。
与对照组比较，模型组大鼠肾重指数明显升高（P<0.05）；与模型组比较，YSJT-L、YSJT-H和达格列净组大鼠肾重指数明显降低（P<0.05）；与达格列净组比较，YSJT-L大鼠肾重指数明显升高（P<0.05），而YSJT-H大鼠体重指数与达格列净组比较无统计学差异（P>0.05）。见
| 组别 | n | 肾重指数 |
|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 0.99±0. 06 |
| 模型组 | 6 |
1.86±0.1 |
| YSJT-L | 6 |
1.58±0.1 |
| YSJT-H | 6 |
1.49±0.0 |
| 达格列净组 | 6 |
1.38±0. 0 |
注： 与对照组比较
h-UTP的影响 模型组大鼠FBG较对照组显著升高（P<0.01），且明显高于YSJT-L、YSJT-H及达格列净组（P<0.01），而达格列净组FBG明显低于YSJT-L、YSJT-H（P<0.05）；模型组大鼠24 h-UTP显著高于对照组、YSJT-L、YSJT-H与达格列净组（P<0.01），而YSJT-L、YSJT-H及达格列净组三组间24 h-UTP水平比较无统计学差异（P>0.05）。见
| 组别 | n | FBG（mmol/L） | 24 h-UTP（mg） |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 4.63±0.31 | 3.61±1.27 |
| 模型组 | 6 |
30.93±3.1 |
38.21±6.9 |
| YSJT-L | 6 |
26.18±3.4 |
25.01±5.6 |
| YSJT-H | 6 |
22.95±2.3 |
23.08±6.5 |
| 达格列净组 | 6 |
20.32±2.5 |
23.21±5.8 |
注： 与对照组比较
HE染色下对照组大鼠的肾组织结构完整，无明显病理变化；而模型组的肾脏组织可见明显的结构紊乱，肾小管显著扩张，肾小管上皮细胞明显变性及肿胀，细胞胞质疏松且色泽较淡，肾间质出现增宽现象。在YSJT-L、YSJT-H与达格列净组中，肾小管的扩张和肾小管上皮细胞的变性肿胀程度均较轻。Masson染色下对照组未见明显胶原纤维增生，而在模型组中，肾组织血管周围及肾间质区域的胶原纤维增生尤为明显，其余各组与模型组相比病变均减轻。见
图1 各组大鼠肾脏HE、Masson染色（×200）
对照组大鼠肾小球系膜区及肾小管上皮细胞均可见少量TGF-β1、SMAD2/3表达，且肾小管表达较明显；与对照组比较，模型组、YSJT-L、YSJT-H与达格列净组TGF-β1、SMAD2/3表达均明显增强（P<0.01）；与模型组比较，YSJT-L、YSJT-H与达格列净组TGF-β1、SMAD2/3表达均明显减弱（P<0.01）。对照组大鼠肾小球及肾间质可见少量FN、α-SMA表达；模型组、YSJT-L、YSJT-H与达格列净组的肾小球系膜区域，FN及α-SMA的表达水平显著上升，与对照组相比具有显著的统计学差异（P<0.01）；与模型组相比，YSJT-L、YSJT-H与达格列净组FN、α-SMA明显减少（P<0.01）。见
| 组别 | n | TGF-β1 | SMAD2/3 | FN | α-SMA |
|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 6 | 0.27±0.09 | 0.93±0.18 | 0.11±0.03 | 0.12±0.01 |
| 模型组 | 6 |
2.64±0.2 |
4.80±0.8 |
6.55±1.6 |
3.83±0.6 |
| YSJT-L | 6 |
1.09±0.1 |
2.39±0.2 |
1.15±0.4 |
1.35±0.1 |
| YSJT-H | 6 |
0.99±0.2 |
2.21±0.3 |
0.85±0.2 |
1.24±0.1 |
| 达格列净组 | 6 |
0.92±0.2 |
2.26±0.3 |
0.81±0.4 |
1.20±0.1 |
注： 与对照组比较
| TGF-β1 |  | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| SMAD2/3 | |||||
| FN | |||||
| α-SMA | |||||
| 对照组 | 模型组 | YSJT-L | YSJT-H | 达格列净组 | |
DKD归属于中医学“水肿”“肾消”“肾劳”“溺毒”等范畴，病变涉及五脏，与肺、脾、胃、肾相关，且以肾为主，病性总属本虚标实。《灵枢·五变》云“五脏皆柔弱者，善病消瘅”，提示五脏禀赋不足、素体虚弱是DKD发生的潜在根本原因。清·叶天士《临证指南医案》云：“三消一症，虽有上中下之分，其实不越阴亏阳亢，津涸热淫而已。”认为阴津亏损、燥热内盛是三消的病机。现代医家多认为本病由于“消渴”缠绵不愈，致津液不足；或平素嗜食膏粱厚味，或久服温燥之品，致燥热内生，阴津耗伤，气阴亏虚，肾固摄无权，精微下泄而发病。久病入络，瘀血阻滞，血运不通，水湿内生，湿热瘀血蕴结不解，病情缠绵难愈。久则阴伤及阳，致阴阳俱虚。
益肾降糖饮作为临床常用的中药方剂，主要治疗DKD辨证属气阴两虚型者，原方由福建闽山中医肾病学术流派阮诗玮教授创立。全方具有滋阴养血、益肾通络、清利湿热之功。方中何首乌可补肾益精；生地黄凉血养阴生津；当归养血补血；玄参滋阴清热，上四药共为君药，以滋阴养血。生黄芪、太子参补气以助行血；山药益气养阴、补肾涩精；肉苁蓉益肾阳、填肾精，此四药均为臣药。病久入络，常兼湿热瘀血内阻，故加赤芍活血祛瘀，僵蚕祛风通络；气虚日久，水湿内停，日久化热，故予炒苍术健脾燥湿、黄芩清热燥湿、马齿苋清热解毒；同时佐鲜石橄榄以养阴生津，此六味药共为佐药。本研究显示，YSJT-L、YSJT-H大鼠FBG、24 h-UTP均较模型组明显降低，肾重指数及大鼠肾脏病理变化均明显改善，表明益肾降糖饮对DKD大鼠具有明显疗效。
肾纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是DKD重要的病理表现之一，同时又是导致DKD进展的病理因素。RIF的发生发展是一个复杂的生物过程，涉及众多细胞类型、细胞因子以及炎症介质的协同作用及相互影响。在这一过程中，TGF-β1作为一个关键的调节分子，对纤维化过程的推进具有显著作用。在TGF-β1参与的众多信号通路中，TGF-β1/SMAD2/3信号通路是导致DKD纤维化的重要通路之一，亦是治疗DKD的重要靶点。TGF-β1是一种多效性的细胞因子，在肾组织中表达水平较高，主要分布于肾小球和肾小管，不仅能够促进特定细胞的增殖与分化，还能促进胶原蛋白、FN、α-SMA等ECM组分的合成，从而促进ECM的生
综上所述，应用益肾降糖饮干预STZ诱导的DKD模型大鼠，可通过抑制TGF-β1/SMAD2/3信号通路的活性，下调FN、α-SMA表达，减少ECM沉积，改善肾纤维化，延缓DKD进展，且益肾降糖饮改善大鼠血糖、减少尿蛋白及抑制DKD肾纤维化的疗效不劣于达格列净组。
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