摘要
将60只大鼠随机均分为正常组、模型组、阳性药组（麻芩消咳颗粒组）及通腑泻肺灌肠液高、中、低剂量组，采用烟雾吸入法构建大鼠急性支气管炎模型。每天灌肠给药1次，连续给药7 d，比较不同组别的肺组织病理形态学结果及白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平；比较通腑泻肺灌肠液体外供试品及含药血清样品和空白血清样品的HPLC色谱图，根据保留时间及对照品，明确通腑泻肺灌肠液给药后血中入血成分。
与模型组比较，不同剂量的通腑泻肺灌肠液可以不同程度地改善急性支气管炎大鼠倦怠、食欲减退、皮毛松弛以及支气管和肺组织的损伤；通腑泻肺灌肠液各剂量组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量与模型组相比呈不同程度的减低（P<0.01）；给药后血清样品有9个入血成分，5个血中移行成分，3个体内代谢成分，通过与对照品比对，指认出7个成分，初步预测没食子酸和厚朴酚为通腑泻肺灌肠液的入血成分。
急性支气管炎是儿童较为常见的呼吸系统疾病，主要以咳嗽、咳痰、发热为临床表
崔应麟教授（以下简称“崔教授”）是第二届全国名中医，其长期从事中医临床、科研与教学工作，对中医灌肠疗法有深入研究，完成著作《中医灌肠疗法》，研制了“通腑泻肺灌肠液”医院制剂。通腑泻肺灌肠液由麻黄6 g、炒苦杏仁10 g、大黄6 g、生石膏30 g、瓜蒌24 g、甘草6 g组成，具有清宣肺气，通腑泻热之功，主治邪毒闭肺，热结肠燥证，常用于治疗急性支气管炎、支气管哮喘等呼吸系统疾病。崔教授认为，肺气受外邪侵袭会出现肺气郁闭，肺中痰浊化热后进而出现肠燥热结证，临床表现为咳嗽、黄痰，或兼喘息不宁等症状。此时通过清宣肺气，通腑泻热，可促使痰湿热毒从肠道排出，邪热从皮表外散，起到祛邪扶正的作用。通腑泻肺灌肠液不经过肝脏作用，直接进入大循环，可减少药物刺激，改善肠道的微生态环境，增加有益菌群，还可避免儿童吃药或打针时所产生的恐惧心理，减轻用药困难，且不易导致呕吐。因此该剂型深受儿童家长的喜欢，但其药效物质基础与作用机制尚未完全阐明。
中药血清药代动力
体质量为180~220 g的SPF级雄性SD大鼠60只，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，动物合格证号：SCXK（鲁）2020003。实验过程严格遵守“3R”原则。动物伦理审查批准编号DWLLGZR202202211。动物置于实验环境中饲养，在正常的光照条件下，大鼠可自由饮水和进食。
麻黄、炒苦杏仁、大黄、生石膏、瓜蒌、甘草饮片及麻芩消咳颗粒经河南中医药大学药学院张振凌教授鉴定均为正品。样品信息见
| 药材 | 生产厂家 | 批号 |
|---|---|---|
| 麻芩消咳颗粒 | 天长亿帆制药有限公司 | Z20040092 |
| 麻黄 | 康美药业股份有限公司 | 20230201 |
| 生石膏 | 康美药业股份有限公司 | 20230201 |
| 炒苦杏仁 | 康美药业股份有限公司 | 20230201 |
| 瓜蒌 | 康美药业股份有限公司 | 20230201 |
| 大黄 | 康美药业股份有限公司 | 20230201 |
| 甘草 | 康美药业股份有限公司 | 20230201 |
试剂与仪器的生产厂家及批号见
| 试剂与仪器 | 生产厂家 | 批号 |
|---|---|---|
| IL-6 ELISA试剂盒 | 江苏酶免实业有限公司 | MM-0190R1 |
| L-1β ELISA试剂盒 | 江苏酶免实业有限公司 | MM-0047R1 |
| TNF-α ELISA试剂盒 | 江苏酶免实业有限公司 | MM-0180R1 |
| 酶标分析仪 | 美国Bio-Rad公司 | 20180908 |
| 高速冷冻离心机 | 上海伊沐医疗器械有限公司 | 20170312 |
| 超纯水系统 | 美国Millipore公司 | 20191203 |
| 电子天平 | 北京赛多利斯科学仪器有限公司 | 20170823 |
| 大黄酚 | 中国食品药品检定研究院 | 110796-201922 |
| 香草酸 | 中国食品药品检定研究院 | 110776-201805 |
| 没食子酸 | 中国食品药品检定研究院 | 110736-200526 |
| 大黄酸 | 中国食品药品检定研究院 | 110757-201607 |
| 盐酸伪麻黄碱 | 中国食品药品检定研究院 | 171237-201510 |
| 盐酸麻黄碱 | 中国食品药品检定研究院 | 171241-201809 |
| 厚朴酚 | 中国食品药品检定研究院 | 110729-202015 |
| 芦荟大黄素 | 中国食品药品检定研究院 | 110795-201609 |
| 没食子酸甲酯 | 中国食品药品检定研究院 | 111549-201605 |
| 甲醇 | 安徽天地高纯溶剂有限公司 | 20231002 |
| 乙腈 | 安徽天地高纯溶剂有限公司 | 20231005 |
| 磷酸 | 天津市科密欧化学试剂有限公司 | 20230919 |
| 甲酸 | 天津市大茂化学试剂厂 | 20230919 |
| 水 | 实验室自制 | 20230919 |
大鼠购入后适应性饲养3 d，随后将大鼠随机分为正常组、模型组、麻芩消咳颗粒组（0.24 g/kg，简称为“阳性药组”），以及通腑泻肺灌肠液高、中、低剂量组（分别简称为“高剂量组”“中剂量组”“低剂量组”，给药浓度分别为20 mL/kg、10 mL/kg、5 mL/kg），每组10只。除去正常组，其余组大鼠置于自制的烟箱中，每次用香烟20支烟雾刺激1 h，每日2次，共14
灌肠给药7 d后，大鼠禁食12 h（不禁水）。打开大鼠腹腔，用注射器抽取腹主动脉血4 mL，置于采血管室温静置，完全凝固后，以3000 r/min离心5 min分离血清，置于-80 ℃冰箱保存。同时取肺组织用4%多聚甲醛固定，用于HE染色。
色谱条件见
| 项目 | 具体内容 |
|---|---|
| 色谱柱 | Sunfire C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） |
| 流动相 | A为乙腈，B为0.3%磷酸水溶液 |
| 梯度洗脱程序 | 0~28 min，5%A~20%A；28~50 min，20%A~26%A；50~55 min，26%A~31%A；55~68 min，31%A~36%A；68~80 min，36%A~42%A；80~85 min，42%A~52%A；85~92 min，52%A~69%A；92~102 min，69%A~85%A；102~106 min，85%A~100%A；106~110 min，100%A~5%A |
| 流速 | 1 mL/min |
| 柱温 | 30 ℃ |
| 检测波长 | 210 nm |
| 进样量 | 10 μL |
称取麻黄6 g、生石膏30 g（先煎）、炒苦杏仁10 g、瓜蒌24 g、大黄6 g（后下）、甘草6 g，将药材置于电陶瓷壶中，煎煮2次。第1次生石膏加8倍量水先煎煮30 min，煎好后，将生石膏和水煎液倒入加8倍量水浸泡的麻黄、炒苦杏仁、瓜蒌、甘草中，煎煮20 min，再加入大黄共煎10 min，滤过；第二次煎煮加6倍量水，煎煮30 min，煎液滤过，将2次过滤得到的药液混合，减压蒸干，残渣加50%甲醇溶解并定容到5 mL量瓶中，摇匀滤过即得。
分别取没食子酸、盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、没食子酸甲酯、香草酸、芦荟大黄素、厚朴酚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，分别制成质量浓度为0.32、0.23、0.28、0.35、0.22、0.24、0.36 mg/mL的混合对照品溶液。
取-80 ℃保存的血清样本，于4 ℃下解冻；取血清样本和甲醇以1∶1混合于2 mL离心管，在4 ℃下，以12000 r/min离心15 min，全部上清液用移液枪吸出至离心管后进行氮吹；加入50 μL甲醇复溶残渣，在4 ℃下，12000 r/min离心15 min，取上清液用于测定。
正常组大鼠饮食正常、呼吸均匀，毛发顺滑有光泽，较活跃，没有咳嗽和咳喘等症状。模型组大鼠出现疲劳、行动迟缓、食欲减退、毛发松弛枯燥，伴随咳嗽、喘息；随着烟熏时间的加长，症状逐渐加重。给药后，与模型组比较，通腑泻肺灌肠液各剂量组及阳性药组大鼠活动频率和饮食增加，咳嗽和呼吸急促等状态有不同程度的改善，症状减轻。
HE染色结果显示，正常组大鼠肺泡结构清晰，肺泡腔内无渗出；模型组大鼠支气管壁局部增厚，有肺泡壁增厚、黏膜充血、水肿等情况；通腑泻肺灌肠液各剂量组及阳性药组大鼠气管内分泌物、肺泡壁厚度较模型组显著减少，炎症细胞浸润等症状较模型组显著改善。见
图1 通腑泻肺灌肠液对急性支气管炎模型大鼠肺组织病理形态学的影响（HE染色，×200）
模型组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量与正常组比较显著升高（P<0.01）；通腑泻肺灌肠液各剂量组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量与模型组相比呈不同程度的减低（P<0.01）。见
图2 通腑泻肺灌肠液对急性支气管炎模型大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 含量的影响
与正常组比较
取同一批次通腑泻肺灌肠液中剂量组大鼠血清，按照“2.5”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.4”项下色谱条件进样分析，结果各共有峰的相对保留时间RSD<2.89%，相对峰面积RSD<2.50%，表明该方法重复性良好。
对大鼠灌肠给药后血清样品图谱进行色谱指纹图谱相似度分析，获得其共有峰。根据其相应数据，与体外供试品的HPLC图谱色谱峰比较，结果发现通腑泻肺灌肠液给药后血清样品有9个入血成分（峰1、峰4、峰6、峰8、峰10、峰11、峰12、峰13、峰14），有5个血中移行成分（峰2、峰3、峰5、峰7、峰9），有3个体内代谢成分和应激产物（峰15、峰16、峰1）。通过与对照品比对，推测峰1为没食子酸、峰2为盐酸麻黄碱、峰3为盐酸伪麻黄碱、峰5为没食子酸甲酯、峰7为香草酸、峰9为芦荟大黄酸、峰11为厚朴酚。见
图3 通腑泻肺灌肠液给药大鼠血中多种成分HPLC图
S1.空白血清；S2.混合对照品；S3.高剂量血清；S4.中剂量血清；S5.低剂量血清；S6.体外供试品；1.没食子酸；2.盐酸麻黄碱；3.盐酸伪麻黄碱；5.没食子酸甲酯；7.香草酸；9.芦荟大黄酸；11.厚朴酚
急性支气管炎是呼吸系统常见
目前支气管炎造模的方法较多，如采用注入脂多糖、氨水雾化、二氧化硫吸入、定点种植流感病毒
通腑泻肺灌肠液乃《伤寒论》中的麻杏石甘汤与《温病条辨》记载的宣白承气汤的合方，是全国名中医崔教授的经验方，已在临床应用30余年。此方是在“六腑以通为用”思想指导下形成的，与“醒脑灌肠液”“通脉祛浊散”等中药制剂一脉相承。通腑泻肺灌肠液由麻黄、生石膏、炒苦杏仁、瓜蒌、大黄、甘草组成，具有清宣肺气、通腑泻热之功，药简力专。方中麻黄为君，生石膏为臣，麻黄味辛、温，可使肺气宣畅而宣肺平喘，散寒通滞以逐经络阴寒之邪，然麻黄性温，故方中生石膏数倍于麻黄，使麻黄宣肺而不助热，麻黄使生石膏清泻肺中壅热而不凉遏；炒苦杏仁、大黄、瓜蒌为使，与麻黄相伍一宣一降，旨在恢复肺之气机升降出入之序；甘草既可缓和麻黄辛温发散较强之性，又可协助麻黄宣肺而达到补气之功，还可辅助生石膏清热益气生津，能调和药性而达到清宣肺气，通腑泻热之功。其中，炒苦杏仁苦降肺气，药性平和，又略兼宣散之性；大黄、瓜蒌肃降肺气，使肺中痰湿为邪热得以从肠道排出；炒苦杏仁、大黄、瓜蒌得生石膏可使肺中邪热得以降泻，以复肺气清肃之令。
IL-6、IL-1β和TNF-α是炎症发生、发展过程中起重要作用的细胞炎症因子。本研究结果表明，正常组大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著低于模型组。可见，IL-6、IL-1β和TNF-α是急性支气管炎发病机制中的重要促炎因子，也是引起气道高反应性的关键因素。通腑泻肺灌肠液高剂量组与阳性药组血清中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平较模型组明显下降，中剂量组与低剂量组有不同程度的降低，这与促炎因子与抗炎因子系统之间的不平等导致气道炎症引起的急性支气管炎的结论一致。对血中多种成分 进行分析，可以为筛选通腑泻肺灌肠液的Q-marker（质量标志物）提供可行依
综上所述，通腑泻肺灌肠液各剂量组可以不同程度降低急性支气管炎模型大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，推测其可以显著改善大鼠的整体状态，作用机制可能与IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子有关，通过血清指纹图谱研究方法初步确定通腑泻肺灌肠液的入血成分为没食子酸和厚朴酚。本研究结果可为通腑泻肺灌肠液治疗急性支气管炎提供试验数据，具有一定的临床意义。
参考文献
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