摘要
制备大鼠含药（黄芪-桑白皮）血清，采用10%香烟烟雾提取物和20 ng·m
与空白组比较，模型组BEAS-2B细胞活性降低（P<0.05），Caspase3、HIF-1α蛋白表达显著增多（P<0.05），提示COPD造模成功；与模型组比较，中药组BEAS-2B细胞活性升高（P<0.05），中药组Caspase3、HIF-1α蛋白表达明显降低（P<0.05）。
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以呼吸困难、咳嗽、咳痰为特征的一种异质性肺部状态，乃气道异常或肺泡异常所导致的持续性进展性的气流阻塞。据WHO预计，COPD将在2030年排名全球第3位死
COPD归属于中医学“喘证”“肺胀”“咳嗽”等范畴，主要症状为咳、痰、喘、气促等，其发病机制以正虚痰瘀为主，治疗上应以扶正为主，佐以化痰活
黄芪-桑白皮是临床治疗COPD的常用药对，经典方剂补肺汤、黄芪
笔者团队前期已通过网络药理学研
7只SPF级SD大鼠，体质量为（250±50） g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证编号为SYXK（湘）—20190009，实验动物伦理批号：LLBH-202212030001。动物饲养环境的相对湿度为40%～70%，温度为24～26 ℃，每小时通风换气8～12次。
（1）中药：黄芪6 g，桑白皮12 g。中药饮片购自湖南省中西医结合医院，加水熬煮30 min，熬2次，过滤，浓缩得到生药质量为4 g/mL的药液备用。（2）西药：注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（天津金耀药业有限公司，国药准字H20103047）。
台式冷冻离心机（湖南湘仪，货号H1650R）；电泳仪（北京六一，货号DYY-6C）；电泳槽（北京六一，货号DYCZ-24DN）；转膜仪（北京六一，货号DYCZ-40D）；旋涡混合器（江苏其林贝尔，货号GL-88B）；还原型5XSDS上样缓冲液（abiowell，货号AWB0055）；1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）（abiowell，货号AWB0073）；1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）（abiowell，货号AWB0074）；10％APS（abiowell，货号AWB0093）；10％SDS（abiowell，货号AWT0047）；TEMED（abiowell，货号AWB0068）；PBST 缓冲液（abiowell，货号AWI0130）；30％Acr/Bic（abiowell，货号AWB0020）；电泳液缓冲液（abiowell，货号AWB0083）；转膜缓冲液（abiowell，货号AWC0114）；蛋白磷酸酶抑制剂（abiowell，货号AWH0650）；SuperECL Plus 超敏发光液（abiowell，货号AWB0005）；显影液（上海佳信，货号BW-61）；定影液（上海佳信，货号BW-62）；抗体HIF1a（英国abcam，货号ab179483）；抗体Caspase3（英国abcam，货号ab184787）；脂多糖（碧云天，ST1470-10 mg）；β-actin（美国proteintech，货号66009-1-Ig）。
香烟烟雾提取物（Cigarette smoke extract，CSE）溶液制备方法如下：取1支香烟燃烧5 min，烟雾在注射器驱动吸引下溶于10 mL 37 ℃预热的PBS溶液中，pH调节至7.4左右，经0.22 μm滤膜过滤除菌后，作为100% CSE 原液，用无血清培养液稀释成10%CSE溶液。
按照千克体重剂量折算法：大鼠剂量（mg·k
实验细胞为人支气管上皮细胞（Bronchial Epithelium transformed with Ad12-SV40 2B，BEAS-2B），购自北纳创联生物科技有限公司，细胞培养在湖南中医药研究院细胞实验室，培养箱设置为37 ℃，5%浓度二氧化碳（CO2）。BEAS-2B细胞用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM培养液培养，换液24 h/次，按1∶2比例传代。
取对数生长期细胞进行实验，将DMEM培养液+10% FBS加入T25培养瓶中，于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h，细胞贴壁后去除原培养基，加入无血清DMEM培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱饥饿培养24 h；再去除原培养基，以培养瓶为单位，将其随机分为空白组、模型组、中药组、西药组。（1）空白组：常规培养基培养24 h；（2）模型组：10% CSE和20 ng·m
按照“1.7”所述分组，将CCK-8 溶液加入细胞培养液中，孵育2.5 h后，酶标仪测定450 nm处吸光度值。细胞存活率=100%-（正常细胞组吸光值-加药组吸光值）/（正常细胞组）×100
blot蛋白检测 采用 Western Blot 检测空白组、模型组、中药组和西药组细胞中Caspase3、HIF-1α蛋白相对表达量，通过裂解细胞提取蛋白、蛋白定量、电泳、转膜、封闭、一抗(Caspase3稀释比例1∶2000，HIF-1α稀释比例1∶1000，β-actin 稀释比例1∶5000)孵育、二抗(HRP goat anti-mouse IgG稀释比例1∶5000，HRP goat anti-rabbit IgG稀释比例1∶5000)孵育、显影以测定各样本蛋白相对表达量。
空白组、模型组、中药组、西药组细胞培养按照1.7所述方法进行培养24 h后，在400倍显微镜下观察BEAS-2B细胞数量和形态（见
图1 显微镜下各组BEAS-2B细胞形态
长度标尺200 μm，放大倍数40×10倍
10% CSE和20 ng·m
| 组别 | 450 nm 吸光光度值（OD 值） |
|---|---|
| 空白组 | 1.11±0.64 |
| 模型组 |
0.57±0.1 |
| 中药组 |
0.84±0.2 |
| 西药组 |
1.04±0.2 |
注： 与模型组比较
blot分析结果 与空白组比较，模型组的Caspase3、HIF-1α蛋白条带增粗且颜色加深（P<0.05），证明模型建立成功。与模型组相比，西药组、中药组的Caspase3、HIF-1α蛋白条带不同程度地变细，颜色变浅，西药组比中药组蛋白条带更细更浅（P<0.05）。这说明甲泼尼龙、黄芪-桑白皮均可抑制Caspase3、HIF-1α的表达，其中甲泼尼龙抑制程度更大。见
图2 各组细胞Caspase3、HIF-1α表达比较（±s，n=2）
模型组与空白组比较
图3 Western blot分析各组细胞中Caspase3、HIF-1α含量
COPD属于中医学“肺胀”“喘证”等范畴，主要表现为反复咳嗽、咯痰、喘息、胸闷。《景岳全书·喘促》云：“盖实喘者有邪，邪气实也；虚喘者无邪，元气虚也。”本病病性为本虚标实，发作期偏于标实，缓解期偏于本虚，气虚贯穿COPD整个疾病过程。黄芪-桑白皮是临床治疗COPD的常用药对。其中，黄芪补脾益肺，扶正固本，为补气首选；桑白皮具有泻肺平喘的功效，现代药理研究表示，桑白皮能够抑制金黄色葡萄球菌的活性，具有清肺消痰、降气平喘之
COPD的特征是持续气流受限和急性加重，气流受限通常是持续且逐渐发展的，与慢性炎症反应有关。COPD的病理机制尚未明确，目前所被接受的主要包括炎症假说、氧化和抗氧化失衡的假说，以及免疫和蛋白酶和抗蛋白酶的假
香烟烟雾被认为是COPD发病的关键因素，香烟烟雾会引起内质网应激和线粒体功能障
BEAS-2B细胞是由腺病毒12-SV40转染的“正常”人支气管上皮细胞系。该细胞系能够替代目前无法获得的正常人支气管上皮细胞，具有来源稳定、易于培养、稳定性好、表达多种肺上皮细胞标志物等优点，可用于评估细胞的表型特征以及研究肺上皮的生理和病理过程，并在众多毒理学和癌症转化实验中作为相关研究的模
综上所述，本研究发现黄芪-桑白皮药对可能通过抑制Caspase3、HIF-1α蛋白的表达，影响肺部细胞对炎症和氧化应激的反应，证实了黄芪-桑白皮药对通过多靶点和多通路发挥治疗慢性阻塞性肺病的作用。后续还可对黄芪-桑白皮药对调控Caspase3、HIF-1α蛋白的作用机制进行深入研究。
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