摘要
采用网络药理学方法，通过中药系统药理学分析平台、UniProt数据平台、GeneCards数据库、OMIM数据库、Drug Bank数据库、微生信息数据处理平台、String数据库、Cytoscape3.9.1软件、DAVID数据库等，筛选出鱼腥草的活性成分、对应靶点及相关信号通路，并运用Autodock Vina软件、Pymol软件对关键活性成分及核心靶点进行分子对接。
鱼腥草治疗前列腺癌的共同靶点有98个，PPI网络分析显示EGFR、AKT1、ESR1、HRAS等为关键靶点，KEGG富集分析显示癌症通路、前列腺癌通路、PI3K-Akt信号通路是鱼腥草作用于前列腺癌的关键通路。分子对接结果显示，鱼腥草治疗前列腺癌的主要活性成分菠菜甾醇、山奈酚、鱼腥草素等与核心蛋白AKT1、ESR1等存在较好的结合性。
前列腺癌（prostate cancer，PCA）是指发生在前列腺上皮细胞的恶性肿瘤。前列腺癌在全球的发病率不断上升，是严重威胁男性健康的常见恶性肿瘤之一。多数患者确诊时已处于晚
网络药理学可以反映和明确多种化合物、多个靶点、多种途径之间的相互作用关系，是当前的研究热点。本研究通过网络药理学方法，探究鱼腥草抗前列腺癌的作用机制、关键靶点及关键活性成分，希望为鱼腥草抗前列腺癌的临床研究和进一步开发提供更多的参考。
通过搜索中药系统药理学分析平台（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php）筛选鱼腥草有效成分，设置条件为口服生物利用度（OB）≥30%，类药性≥0.1
以“prostatic cancer”作为关键词，通过GeneCards数据库（https//www.genecard.org）、OMIM数据库（https://www.omim.org/）、Drug Bank数据库（https://go.drugbank.com/）查找前列腺癌相关靶点，并对上述3个数据库获得的靶点进行整理、合并、去重。通过微生信息数据处理平台（http://www.bioinformatics.com.cn/），将前列腺癌相关的疾病靶点和鱼腥草药物活性成分靶点取交集，绘制Venn图，获得鱼腥草治疗前列腺癌的潜在治疗靶点。
将潜在治疗靶点上传String数据库（https://cn.string-db.org/），设置最小相互作用阈值为0.4，蛋白种类为Homo sapiens，将从String数据库得到的蛋白质互作数据导入软件Cytoscape3.9.1，运用Network analyzer功能及CytoNCA功能分析靶点度（degree）值，根据度值大小排列。度值越大，说明该靶点在鱼腥草发挥抗肿瘤中的作用越关键，为鱼腥草治疗前列腺癌的核心靶点。
将药物活性成分及交集靶点和疾病导入Cytoscape3.9.1软件，构建“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络（target-pathway），便于数据可视化分析。通过对网络图进行分析，筛选出鱼腥草治疗前列腺癌的关键成分。
DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）是用于基因注释、分类、富集和途径分析的在线工具。使用DAVID工具进行GO基因功能和KEGG信号通路富集分析，设定参数Select Identifier为“official gene symbol”，List Type选择“gene list”，物种选择“homo sapiens”，以“阈值P<0.05”为条件；并使用微生信息数据处理平台（http://www．bioinformatics.com.cn） 对结果进行可视化处理，选择关系密切的分析结果进行绘图。
共检索到7个活性成分，主要为异热马酮、山奈酚、1-甲基-2-二十九烷基-4-喹诺酮（1-甲基-2-九糖基-4-喹诺酮）、波菜甾醇、槲皮素、黄夹次苷丙等；同时查找文献发现鱼腥草中β-谷甾醇、鱼腥草素对前列腺癌细胞有抑制作
| 分子编码 | 活性成分 | OB（%） | DL |
|---|---|---|---|
| MOL003851 | 异热马酮 | 39.97 | 0.51 |
| MOL000422 | 山奈酚 | 41.88 | 0.24 |
| MOL004345 | 1-甲基-2-二十九烷基-4-喹诺酮 | 31.54 | 0.50 |
| MOL004350 | 黄夹次苷丙 | 36.12 | 0.76 |
| MOL004351 | 金合欢素 | 37.28 | 0.25 |
| MOL004355 | 波菜甾醇 | 42.98 | 0.76 |
| MOL000098 | 槲皮素 | 46.43 | 0.28 |
| MOL001986 | β-谷甾醇 | 5.84 | 0.71 |
| MOL004359 | 鱼腥草素 | 36.04 | 0.04 |
通过检索GeneCards、OMIM和Drug bank 3个数据库分别筛选到798、492、22个疾病相关基因，将得到的基因靶点汇总去重，最终得到1158个疾病靶点。将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集，绘制Venn图，得到与前列腺癌相关的药物活性成分靶点98个，见
图1 鱼腥草治疗前列腺癌靶点Venn图
将潜在治疗靶点上传String数据库建立PPI网络，通过软件Cytoscape3.9.1，运用Network analyzer功能及CytoNCA功能分析，共有96个靶点蛋白节点（有2个靶点游离），2560条边，颜色较深、半径较大的为表皮生长因子受体（EGFR）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、雌激素受体1（ESR1）、HRas原癌基因(HRAS)、半胱天冬酶-3(CASP3)等靶点蛋白，见
图2 鱼腥草治疗前列腺癌交集靶点PPI网络
| 编号 | 靶点蛋白 | 度 | 介数中心性 | 中心接近度 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 表皮生长因子受体（EGFR） | 150 | 0.114 | 0.826 |
| 2 | RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1） | 148 | 0.073 | 0.819 |
| 3 | 半胱天冬酶-3（CASP3） | 130 | 0.033 | 0.754 |
| 4 | 原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC） | 128 | 0.028 | 0.742 |
| 5 | HRas原癌基因（HRAS） | 128 | 0.043 | 0.754 |
| 6 | 雌激素受体1（ESR1） | 128 | 0.063 | 0.748 |
| 7 | 热休克蛋白90α家族A类成员1（HSP90AA1） | 124 | 0.031 | 0.736 |
| 8 | 胰岛素样生长因子I（IGF1） | 120 | 0.031 | 0.725 |
| 9 | 基质金属蛋白酶-9（MMP9） | 108 | 0.028 | 0.693 |
| 10 | 膜联蛋白A5（ANXA5） | 104 | 0.013 | 0.683 |
将98个潜在治疗靶点上传String数据库得到的蛋白质互作数据导入软件Cytoscape3.9.1，使用Cytoscape3.9.1软件构建“鱼腥草-活性成分-共同靶点-疾病”网络图，见
图3 鱼腥草治疗前列腺癌的“药物－活性成分－共同靶点－疾病”网络图
GO分析结果显示，生物学过程（BP）共富集464个条目，主要涉及信号转导、凋亡过程的负向调控、细胞迁移的正向调控、蛋白质磷酸化、细胞增殖的正调控、蛋白质自磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导的积极调控等生物学过程相关；细胞组分（CC）共富集63个条目，主要涉及细胞溶质、细胞质、核、黏附斑、富含无花果蛋白酶-1的颗粒腔、受体复合物、核质等；分子功能（MF）共富集96个条目，主要与蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、蛋白激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、配体激活的序列特异性DNA结合、蛋白酪氨酸激酶活性、ATP结合等功能有关。因富集条目较多，选取排名前10的通路建立柱状图，见
图4 鱼腥草治疗前列腺癌的GO富集分析
KEGG信号通路富集分析结果显示，鱼腥草治疗前列腺癌的主要靶点主要涉及癌症通路、前列腺癌通路、PI3K-Akt信号通路、FoxO信号通路、Ras信号通路等，见
图5 鱼腥草治疗前列腺癌的KEGG信号通路富集分析
图6 鱼腥草治疗前列腺癌的KEGG通路-交集靶点网络图
| KEGG通路 | 基因数 | 靶点名称 |
|---|---|---|
| 癌症通路 | 50 | GSK3B， IGF1R， CASP7， CASP3， AKT2， PIM1， AKT1， RAC1， JAK2， HRAS， MAP2K1， HSP90AA1， APAF1， MMP1，MMP2， MMP9， RHOA， TGFBR1， CCNA2， AR， KIT， RARB， PPARG， RAF1， MET， GSTP1， XIAP， PIK3R1， EGFR，MAPK8， ABL1， CTNNA1， MAPK1， NQO1， TGFB2， GSTM1， STAT1， IGF1， ESR1， ESR2， IL2， PTK2， MAPK10， BMP2，CDK6， CDK2，MDM2， FGFR2， FGFR1， BCL2L1 |
| PI3K-Akt信号通路 | 31 | GSK3B， PIK3R1， EGFR， PIK3CG， IGF1R， ERBB4， AKT2， KDR， AKT1， MAPK1， RAC1， JAK2， HRAS， EIF4E，MAP2K1， HSP90AA1， NOS3， PDPK1， IGF1， IL2， PTK2， CDK6， KIT， CDK2， MDM2， RAF1， MET， FGFR2， FGFR1，BCL2L1， EPHA2 |
| 肿瘤蛋白多糖通路 | 29 | SRC， PIK3R1， EGFR， IGF1R， CDC42， PLAU， ERBB4， CASP3， AKT2， KDR， AKT1， MAPK1， RAC1， HRAS， TGFB2，MAP2K1， MMP2， PTPN11， IGF1， MAPK14， MMP9， ESR1， RHOA， PTK2， MDM2， GRB2， RAF1， MET， FGFR1 |
综和核心靶点PPI网络与KEGG通路-核心靶点网络图选取AKT1、HRAS2与鱼腥草核心成分进行分子堆积，通过
| 活性成分 | 靶蛋白名 | 结合能（kcal/mol） |
|---|---|---|
| 波菜甾醇 | HRAS | -9.84 |
| 山奈酚 | AKT1 | -4.91 |
| 山奈酚 | HRAS | -4.98 |
| 鱼腥草素 | AKT1 | -3.22 |
| 鱼腥草素 | HRAS | -4.97 |
图7 波菜甾醇和HRAS分子对接
网络药理学是多学科相互交融，构建“药物-靶点-基因-疾病”网络，综合分析药物与疾病的相互作用，揭示药物协同作用于人体的机理的一门新学
“药物-活性成分-共同靶点-疾病”网络图运用Betweenness、Degree算法拓扑分析，综合分析鱼腥草活性成分，结果得出排名较前的活性成分分别为菠菜甾醇、山奈酚、鱼腥草素、槲皮素、β-谷甾醇。β-谷甾醇可直接作用到AKT1、HRAS、RHOA、CASP3、SRC、ESR1等关键靶点。波菜甾醇为植物甾醇的一种类
本研究通过分子对接发现，山奈酚、鱼腥草素与AKT1、HRAS等关键靶点具有良好的的结合力；KEGG富集结果显示，鱼腥草治疗前列腺癌主要通路集中在癌症通路、前列腺癌通路、PI3K-Akt信号通路等，且在上述通路中，均存在AKT1、HRAS等蛋白。本研究通过PPI网络图、GO及KEGG富集分析表明，鱼腥草通过调节ATP结合、丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等，并通过癌症通路、前列腺癌通路、PI3K-Akt信号通路等对PCA起治疗作用。
综上所述，本研究通过网络药理学分析结合本领域相关研究成果得出，HRAS是鱼腥草抑制前列腺癌细胞生长的重要靶点；鱼腥草中以菠菜甾醇、山奈酚、鱼腥草素为主的活性成分与其抑制前列腺癌细胞生长的机制关系最为密切。从本研究结果可推测，鱼腥草主要通过作用于PI3K-Akt信号通路，影响下游HRAS相关蛋白的表达，从而达到抑制前列腺癌细胞增殖的效果。这一推断可以通过深入研究获得验证，并指导进一步临床研究，希望能为鱼腥草的新药开发以及临床应用提供依据。
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