摘要
通过中药系统药理学数据库和分析平台（TCM-SP）数据库进行检索并筛选六君子汤的活性成分及作用靶点，运用Disgenet、MOIM、Genecards数据库检索GID的相关作用靶点，取二者靶点交集，应用STRING平台及Cytoscape3.10.0软件构建活性药物-成分-靶点蛋白-疾病互作网络图。凭借微生信平台对所得交集靶点进行富集分析并绘制GO和KEGG富集分析图，最终使用pymol和AutoDock软件实现分子对接可视化。
六君子汤药物活性成分共131个，药物靶点218个，疾病相关靶点1376个，药物与疾病共靶点108个，GO分析中生物过程3584条，细胞组成186条，分子功能348条，KEGG通路229条，分子对接结果显示主要活性成分与核心靶点对接成功，具有良好的结合活性。
胃肠功能障碍（gastrointestinal dysfunction，GID）常出现在危重患者中，且与临床预后较差相关，是一组涉及胃和肠道的功能性疾病，无明显的器质性病变，可涵盖运动和/或吸收障碍、免疫屏障受损、微生物组变化和灌注受损等。GID主要症状包括腹痛、腹胀、呕吐、便秘、腹泻等，甚者出现肠梗阻、应激性溃疡伴出血等。GID发生机制尚不明确，可能与神经肌肉活动失调、菌群稳态被破坏、免疫系统等相关，多继发于严重感染、神经功能障碍
多靶点作用是中草药治疗疾病的特点，其多成分作用的复杂机制，可通过网络药理学研究，构建生物分子信息网络，更好地诠释中药的复杂作用机制。分子对接技术通过模拟相互作用状态，以预测药物的活性和作用机制，同时可节省实验时间和成本。本研究通过结合使用网络药理学和分子对接技术，可灵活地实现不同类型中药成分作用于不同靶点状态的可视化，探究六君子汤治疗GID可能存在的分子作用机制。
运用R软件运行程序于中药系统药理学数据库和分析平台（TCM-SP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索，以口服生物利用度（oral bioavalability，OB）≥30%、分子类药性（drug like，DL）≥0.18为限定条件进行筛选，获得六君子汤中6味中药的活性成分，并根据所得活性成分在TCM-SP中找出相应靶点。为便于后续的数据分析，在UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）中检索筛选出的靶点蛋白，即在Uniprot搜索栏中直接点击Search，切换界面后于左侧边栏依次点击“Human”“Reviewed（Swiss-Prot）”，然后在自定义栏目“Customize columns”中加入限定条件“Gene Names（primary）”，最后“Download”所筛选出靶点蛋白的Excel表格，使用基因名（gene name）将靶点蛋白进行统一转化，规范命名。
在DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和OMIM数据库（https：//www.omim.org/）中，以“Gastrointestinal Dysfunction”为关键词检索，将所得靶点蛋白存入Excel进行合并去重，获得GID的疾病作用靶点。
通过上述步骤得到药物靶点与疾病靶点后进行整合，然后导入VENNY 2.1网站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny） 获取交集靶点，可通过绘制韦恩（Venn）图以实现交集靶点的可视化。
上述筛选出的药物活性成分及其靶点，运用Cytoscape 3.10.0软件，构建“六君子汤-成分-靶点蛋白-GID”网络图，即药物活性成分-靶点蛋白-疾病互作图。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析首先由韦恩图所得靶点上传至STRING网站后，勾选“最低要求的互动分数（minimum required interaction score）”为“high confidence（0.9）”，其他设置选择默认，然后进行分析，再导出PPI互作网络分析图及tsv文件，最后利用Cytoscape 3.10.0中Network Analyzer分析PPI网络，筛选其中的重要靶点。
利用六君子汤及GID交集靶点，对所得的核心靶点通过基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）进行通路富集分析，将核心靶点上传至微生信网络分析平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/），分析后可得分子功能（molecular functions，MF）、细胞组成（cellular components，CC）、生物过程（biological processes，BP）和KEGG富集通路，导出可视化结果。
由pymol软件将配体和受体进行修饰，运用AutoDock（一种分子建模模拟软件）进行半柔性对接，以反向验证六君子汤药物活性成分与核心靶点之间的作用关系，以实现计算机的虚拟验证。此外，分子对接存在虚拟筛选的作用，通过虚拟对接所需的结合能以判断分子的结合活性。进行分子对接之前，需依据上述所得药物活性成分、核心共靶点结果，进行再次筛选后方可实行分子对接，在TCM-SP中进行查询并获得活性成分的mol 2结构；在蛋白质结构数据库（protein data bank，PDB）中检索核心靶点，选择并保存其pdb格式文件。准备对接前的配体和受体，首先由AutoDock软件对药物活性成分进行加氢、计算电荷等操作，处理成配体，接下来用pymol对核心靶点蛋白结构进行去配体、加氢、去水等操作，处理蛋白成受体，设置Atoms为Assign AD4 type，处理好的文件均保存为pdbqt格式。采用拉马克遗传算法准备docking文件，进行柔性对接，最后用pymol将所得配体与受体进行分子对接可视化展示。
运用R软件实现在TCM-SP中收集六君子汤活性成分，完成筛选后共获得：党参活性成分17个，茯苓活性成分6个，白术活性成分4个，陈皮活性成分5个，半夏活性成分11个，甘草活性成分88个。将所有活性成分对应靶点进行合并去重，统一基因名后得到潜在靶点蛋白218个。
筛选疾病相关靶点，其中，DisGeNET中获得15个靶点，GeneCards所得数据在Excel中经过三次中位数卡值后获得1362个靶点，OMIM中经去重后获得44个靶点，将所有疾病靶点合并去重后得到1376个靶点蛋白。
将药物靶点与疾病靶点输入Venny2.1.0网络平台，得到交集靶点Venn图（见
图1 六君子汤与GID靶点交集韦恩图
图2 六君子汤与GID交集靶点蛋白PPI图
图3 六君子汤-成分-核心靶点-GID互作网络图
注： 绿色节点代表药物；蓝色节点代表靶点；紫色节点代表活性成分；红色节点代表疾病
| 分子编号 | 分子名称 | OB（%） | DL |
|---|---|---|---|
| MOL000098 | quercetin（斛皮素） | 46.43335 | 0.27525 |
| MOL003896 | 7-Methoxy-2-methyl isoflavone（7-甲氧基-2-甲基异黄酮） | 42.56474 | 0.19946 |
| MOL000006 | luteolin（木犀草素） | 36.16263 | 0.24552 |
| MOL000449 | Stigmasterol（豆甾醇） | 43.82985 | 0.75665 |
| MOL000422 | kaempferol（山奈酚） | 41.88225 | 0.24066 |
| MOL002714 | baicalein（黄芩素） | 33.51892 | 0.20888 |
| MOL000358 | beta-sitosterol（β-谷甾醇） | 36.91391 | 0.75123 |
| MOL005828 | nobiletin（川陈皮素） | 61.66944 | 0.51652 |
| MOL004328 | naringenin（柚皮素） | 59.29390 | 0.21128 |
| MOL000392 | formononetin（芒柄花黄素） | 69.67388 | 0.21202 |
图4 六君子汤与GID核心交集靶点蛋白PPI网络优化图
注： A为79个关键靶点；B为28个核心靶点。节点面积越大，度值越大，颜色越深；面积越大颜色越深表示该靶点越重要、连线越多，关联性越大
进入微生信网络分析平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/），选择GO-KEGG富集分析，提交79个关键靶点[选择物种为“人类（Human，has）”]，获得富集分析图。根据P值（校正后P值）选取与GID相关的前10条，主要包括：脂质与粥样硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、前列腺癌（Prostate cancer）、糖尿病并发症通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、卡波西肉瘤相关病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、丙型肝炎（Hepatitis C）、人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、膀胱癌（Bladder cancer）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、弓形虫病（Toxoplasmosis）等（见
图5 六君子汤与GID KEGG富集分析结果图
GO功能分析中，生物过程主要包括：细胞对化学应激的反应（cellular response to chemical stress）、外源性凋亡信号通路（extrinsic apoptotic signaling pathway）、对活性氧的反应（response to reactive oxygen species）、氧化应激反应（response to oxidative stress）等；细胞组成主要包括：膜筏（membrane raft）、膜微结构域（membrane microdomain）、膜区（membrane region）、小凹（caveola）等；分子功能主要包括：细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、磷酸酶结合（phosphatase binding）、DNA结合转录因子结合（DNA-binding transcription factor binding）、泛素样蛋白连接酶结合（ubiquitin-like protein ligase binding）等（见
图6 六君子汤与GID GO功能分析结果图
依据“药物-成分-核心靶点-疾病”网络中的度（degree）值，选取degree值排名靠前的5个活性成分与核心靶点进行分子对接。根据PPI网络及“通路-靶点-疾病”网络筛选核心靶点，本次研究选取斛皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、木犀草素、豆甾醇、山奈酚分别与STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1靶点蛋白进行分子对接，结合能情况见表（
| 活性成分（Active constituent） | 关键靶点（Key target） | 蛋白质编号（PDB ID） | 结合能（kal/mol）Binding energy |
|---|---|---|---|
| MOL000098 | STAT3 | 6TLC | -7.0 |
| MOL000098 | TP53 | 5O1A | -7.5 |
| MOL000098 | MAPK3 | 3FHR | -6.7 |
| MOL000098 | AKT1 | 6HHF | -9.2 |
| MOL000098 | MAPK1 | 4QTA | -8.9 |
| MOL003896 | STAT3 | 6TLC | -6.5 |
| MOL003896 | TP53 | 5O1A | -8.1 |
| MOL003896 | MAPK3 | 3FHR | -7.2 |
| MOL003896 | AKT1 | 6HHF | -9.4 |
| MOL003896 | MAPK1 | 4QTA | -8.7 |
| MOL000006 | STAT3 | 6TLC | -7.6 |
| MOL000006 | TP53 | 5O1A | -8.0 |
| MOL000006 | MAPK3 | 3FHR | -7.5 |
| MOL000006 | AKT1 | 6HHF | -9.6 |
| MOL000006 | MAPK1 | 4QTA | -9.5 |
| MOL000449 | STAT3 | 6TLC | -6.7 |
| MOL000449 | TP53 | 5O1A | -7.6 |
| MOL000449 | MAPK3 | 3FHR | -7.9 |
| MOL000449 | AKT1 | 6HHF | -9.9 |
| MOL000449 | MAPK1 | 4QTA | -8.0 |
| MOL000422 | STAT3 | 6TLC | -6.6 |
| MOL000422 | TP53 | 5O1A | -7.4 |
| MOL000422 | MAPK3 | 3FHR | -7.2 |
| MOL000422 | AKT1 | 6HHF | -9.2 |
| MOL000422 | MAPK1 | 4QTA | -9.1 |
图7 六君子汤与GID分子对接部分可视化结果图
注： a. 7-甲氧基-2-甲基异黄酮与TP53对接结果；b. 木犀草素与MAPK1对接结果；c. 豆甾醇与AKT1对接结果3 讨论（前文有简写的英文，是否直接用英文表示）
a b c
六君子汤用于治疗危重症中GID兼脾虚证患者，具有限制机体炎症反应、调节免疫功能、改善肠道菌群等临床疗
靶点蛋白中STAT3是人体细胞中信号传导和转录激活因子，研究表明受STAT3调节的神经肽，可随STAT3的下调，而调节胃肠激素，进一步改善胃肠运
信号通路方面，富集分析中AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications信号通路富集了较多的核心靶点蛋白，同时该信号通路与肠道炎症相
分子对接结果显示，豆甾醇与AKT1结合能最小，结合活性最高，代表二者分子之间结合越紧密和稳定，存在较强的相互作用；此结果却不是预想中度值排名最靠前的槲皮素和STAT3，亦或是
综上所述，六君子汤可能是通过槲皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、木犀草素、豆甾醇、山奈酚等有效成分，作用于STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1等靶点，参与AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection等信号通路调节，实现改善胃肠动力、抗炎、免疫、肠道屏障修复等作用以改善GID患者预后，符合中草药经多成分、多靶点、多途径共协同作用治疗疾病的特点。本研究的不足之处在于数据挖掘不够全面，分子对接属虚拟验证层面，药理作用机制有待进一步的实验研究进行验证。
参考文献
SINGH A， DAWSON T M， KULKARNI S. Neurodegenerative disorders and gut-brain interactions［J］. J Clin Invest， 2021，131（13）：e143775. [百度学术]
MAYER E A， NANCE K， CHEN S. The Gut-Brain Axis［J］. Annu Rev Med， 2022，73：439-453. [百度学术]
王彤. 中医药治疗脓毒症胃肠功能障碍的Meta分析［D］. 南京：南京中医药大学， 2020. [百度学术]
上海市中西医结合学会急救专业委员会， 上海市中西医结合学会重症医学专业委员会， 上海市医师协会急诊科医师分会，等.脓毒症急性胃肠功能障碍中西医结合临床专家共识［J］.中华危重病急救医学， 2022，34（2）：113-120. [百度学术]
张羽， 陈腾飞， 张鑫， 等. 刘清泉运用温涩法治疗危重症患者胃肠功能障碍经验［J］. 北京中医药， 2023，42（3）：288-290. [百度学术]
吴国琳. 余国友主任医师论治急危重症并发胃肠功能衰竭经验［J］. 中国中医急症， 2015，24（1）：85-87. [百度学术]
代洪彬， 赵浩， 孔立. 六君子汤治疗脓毒症胃肠功能障碍（脾虚证）的临床研究［J］. 中国中医急症， 2015，24（9）：1533-1534. [百度学术]
章宇环. 六君子汤加味治疗呼吸衰竭伴胃肠功能障碍的临床研究［D］.南京：南京中医药大学， 2021. [百度学术]
潘金波. 香砂六君子汤对老年脓毒症胃肠功能障碍脾胃气虚证患者肠道菌群和免疫功能的影响［J］. 浙江中西医结合杂志， 2022，32（9）：823-826. [百度学术]
韦海， 黄图干， 陈明仁. 香砂六君子汤辅助治疗危重症胃肠功能障碍脾虚证患者的疗效及对炎性因子的影响［J］. 云南中医中药杂志， 2019，40（8）：29-30. [百度学术]
SACCON T D， NAGPAL R， YADAV H， et al. Senolytic Combination of Dasatinib and Quercetin Alleviates Intestinal Senescence and Inflammation and Modulates the Gut Microbiome in Aged Mice［J］. J Gerontol A Biol Sci Med Sci， 2021，76（11）：1895-1905. [百度学术]
祝珊珊， 谭博文， 秦飞， 等. 槲皮素通过PTEN/PI3K/JNK信号通路减轻小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症［J］. 中国病理生理杂志， 2023，39（3）：510-519. [百度学术]
XIE Y， SHI X， SHENG K， et al. PI3K/Akt signaling transduction pathway， erythropoiesis and glycolysis in hypoxia （Review）［J］. Mol Med Rep， 2019，19（2）：783-791. [百度学术]
吴柳， 蒋永艳， 刘微， 等. 槲皮素通过PI3K/AKT/mTOR通路减轻脓毒症小鼠心肌损伤［J］. 中国急救医学， 2021，41（3）：238-243. [百度学术]
李阳杰， 曹瑞梅， 毛雅君， 等. 槲皮素的结构修饰及生物活性研究进展［J］. 中草药， 2023，54（5）：1636-1653. [百度学术]
PARK J H， SURESHKUMAR S， KIM I H. Influences of dietary flavonoid （quercetin） supplementation on growth performance and immune response of growing pigs challenged with Escherichia coli lipopolysaccharide［J］. J Anim Sci Technol， 2020，62（5）：605-613. [百度学术]
AMEVOR F K， CUI Z， NING Z， et al. Synergistic effects of quercetin and vitamin E on egg production， egg quality， and immunity in aging breeder hens［J］. Poult Sci， 2021，100（12）：101481. [百度学术]
吴力超， 李俊峰， 张婷婷， 等. 基于网络药理学和细胞实验探讨豆甾醇抗炎作用［J］. 中成药， 2022，44（2）：609-615. [百度学术]
刘彬， 龙军， 司良毅. 木犀草素通过激活SIRT1减轻脓毒性心脏损伤［J］. 陆军军医大学学报， 2022，44（21）：2165-2173. [百度学术]
蒋家璐， 孙溧， 倪姐， 等. 肠道菌群对半枝莲中活性成分的代谢及其抑制CYP1A1酶的影响［J］. 南京中医药大学学报， 2021，37（02）：225-230. [百度学术]
WANG Y， JIANG H， WANG L， et al. Luteolin ameliorates loperamide-induced functional constipation in mice［J］. Braz J Med Biol Res， 2023，56：e12466. [百度学术]
王惠临， 张立平. 基于网络药理学探讨四逆散治疗功能性消化不良的作用机制［J］. 世界中医药， 2021，16（10）：1507-1513. [百度学术]
孙玉成， 刘晓巍， 片光哲. β-谷甾醇诱导人胃癌细胞自噬与凋亡的作用及机制研究［J］. 中国医师杂志， 2019，21（6）：866-871. [百度学术]
万星， 李相国， 李修贤， 等. Beta-谷甾醇通过抑制TNF-α-NF-κB和TβR1-Smad2/3信号通路抗小鼠肝纤维化损伤［J］. 中国药理学通报， 2020，36（01）：75-80. [百度学术]
HE Y， YANG C， WANG P， et al. Child compound Endothelium corneum attenuates gastrointestinal dysmotility through regulating the homeostasis of brain-gut-microbiota axis in functional dyspepsia rats［J］. J Ethnopharmacol， 2019，240：111953. [百度学术]
ZHANG X， XIAO H， FU S， et al. Investigate the genetic mechanisms of diabetic kidney disease complicated with inflammatory bowel disease through data mining and bioinformatic analysis［J］. Front Endocrinol （Lausanne）， 2022，13：1081747. [百度学术]
POLIZZOTTO M N， ULDRICK T S， WYVILL K M， et al. Clinical Features and Outcomes of Patients With Symptomatic Kaposi Sarcoma Herpesvirus （KSHV）-associated Inflammation： Prospective Characterization of KSHV Inflammatory Cytokine Syndrome （KICS）［J］. Clin Infect Dis， 2016，62（6）：730-738. [百度学术]
