摘要
将12只5 w龄雄性自发性高血压大鼠随机分为模型组、清达颗粒组，每组6只，选取6只雄性同周龄正常血压大鼠作为对照组。清达颗粒组按0.9 g/（kg·d）给予清达颗粒干预，对照组和模型组给予等量生理盐水干预，每日1次，连续8 w。监测大鼠血压和体重，观察各组大鼠心脏重量指数、心脏收缩功能和病理形态、心房钠尿肽（ANP）、脑利钠肽（BNP）的mRNA和蛋白的表达变化，以及p38 MPAK通路相关蛋白的活化。
干预8 w后，与模型组比较，清达颗粒组大鼠血压显著降低（P<0.05），心脏收缩功能显著改善（P<0.05），心脏重量指数显著降低（P<0.05），心肌纤维增粗肿胀、排列紊乱、溶解断裂、炎性细胞浸润等病理情况明显改善，心脏组织ANP、BNP的mRNA和蛋白的表达显著降低（P<0.05），心脏组织p-p38/p38 MPAK蛋白的表达显著降低（P<0.05）。
心脏是高血压最常见的靶器官损害之一，长期高血压导致心肌细胞代偿性增殖，间质细胞分泌增
清达颗粒由天麻、钩藤、黄芩和莲子心组成，全方共奏平肝潜阳、清泄心火的功效，是陈可冀院士临床经验方，主要用于治疗新发1级高血压，临床疗效显著。课题组前期研究发现，清达颗粒可以降低多种高血压动物模型的血压，在改善高血压导致的心肌肥厚及心肌纤维化，抑制心室重构等方面疗效显
12只5 w龄无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）级雄性自发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rat，SHR），6只同周龄正常血压（Wistar-Kyoto，WKY）大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司购入，动物许可证号为SCXK（京）2019-0009。动物饲养于福建中医药大学医学实验动物中心[SYXK（闽）2009-0001]，自由进食、饮水，饲养温度与相对湿度恒定，昼夜交替时间各为12 h。
清达颗粒由江阴天江药业提供（批号：1704306）；苏木素染色液（批号：G1140）、伊红染色液（批号：G1100）购买于北京索莱宝科技有限公司；异氟烷（批号：970-00026-00）购买于深圳瑞沃德生命科技有限公司；组织总RNA提取试剂盒（批号：RE-03011）、逆转录试剂盒（批号：RT-01021）、qRT-PCR试剂盒（批号：QP-01011）购买于FOREGENE公司；ANP抗体（批号：PA5-79758）、BNP抗体（批号：PA5-96084）、BCA蛋白定量分析试剂盒（批号：23227）购买于美国Thermo Fisher Scientific公司；p-p38 MAPK抗体（批号：4511S）、p38 MAPK（批号：8690S）、羊抗兔二抗（批号：7074S）购买于美国 CST 公司；GAPDH抗体（批号：10494-1-AP）购买于美国Proteintech公司；其他试剂购买于上海碧云天及美国MCE公司。
Kent Scinetific CODA八通道无创血压测量仪（美国Kent Scientific公司）；Vero2100超高分辨率小动物彩色超声多普勒成像系统（加拿大Visual Sonics公司）；生物自动脱水仪及石蜡包埋机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；全自动石蜡切片机（德国Leica公司）；Nanodrop One分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；DM4000B显微镜（德国 Leica 公司）；ChemiDoc MP Bio-Rad凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；7500 Real time-PCR 仪（美国 ABI 公司）。
适应性喂养1 w后，将自发性高血压大鼠随机分为模型组（SHR组）和清达颗粒组（SHR+QDG组），每组6只；6只同周龄WKY大鼠作为对照组（WKY组）。清达颗粒组按照0.9 g/（kg·d）将清达颗粒加入一定比例生理盐水溶解，给予灌胃给药；对照组和模型组给予等体积生理盐水，每日1次，连续8 w。
每周固定同一时间，采用无创尾动脉加压法测量血压，记录每只大鼠清醒状态下尾动脉的收缩压（Systolic blood pressure，SBP）、舒张压（Diastolic blood pressure，DBP）和平均动脉压（Mean arterial pressure，MAP），连续监测8 w。
末次给药后，剔除胸部毛发，异氟烷吸入麻醉，采用Vero 2100成像系统检测大鼠心脏收缩功能变化。将探头置于大鼠胸骨左缘，通过M型心动图测量关键指标，计算左心室射血分数（left ventricle ejection fractions，LVEF）和左室短轴缩短率（left ventricle fractional shortening，LVFS），取连续3个周期测量的平均值作为最终结果。
经腹主动脉取血后取出大鼠心脏，切除心耳，清洗干净后，水平方向横切为三部分，中间部分置于4%多聚甲醛固定液中，心尖部分置于-80 ℃超低温冰箱保存。称量大鼠体重（body weight，BW），测量大鼠胫骨长度（tibial length，TL），计算得出大鼠心脏重量指数（Heart Weight Index，HWI）。计算公式：HWI=BW/TL。
1.9 实时荧光定量聚合酶链反应（quantititive reverse transcription，qRT-PCR）检测心脏组织心房钠尿肽（Atrial natriuretic peptide，ANP）、脑利钠肽（Brain natriuretic peptide，BNP）的mRNA表达
提取各组大鼠心脏组织mRNA，逆转录纯化的mRNA，合成cDNA。根据说明书进行qRT-PCR分析。以GAPDH为内参，引物序列见
| 基因名称 | 序列 |
|---|---|
| ANP-F(Rat) | GCTCCCAGGCCATATTGGAG |
| ANP-R(Rat) | CTTCATCGGTCTGCTCGCTC |
| BNP-F(Rat) | TCAAAGGACCAAGGCCCTAC |
| BNP-R(Rat) | TAAAACAACCTCAGCCCGTC |
| GAPDH-F(Rat) | ACGGCAAGTTCAACGGCACAG |
| GAPDH-R(Rat) | GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC |
取出-80 ℃保存的心脏组织，每100 mg加入1 mL Werstern及IP裂解液（裂解液中含有1×Cocktail、1×Phosstop和10×PMSF），震荡涡旋、裂解、离心后，取上清液，采用BCA法定量蛋白浓度。配制SDS-PAGE凝胶，固定于电泳槽中，恒压90 v，30 min；120 v，1 h进行电泳。将凝胶放入转膜夹，在转膜槽中恒压110 V转膜。封闭后按照说明书稀释比例分别孵育一抗（ANP、BNP、p38 MPAK、p-p38 MPAK）、羊抗兔二抗后，使用Image Lab凝胶成像系统进行曝光，应用Image J软件进行定量分析。
每周血压监测发现，与WKY组相比，SHR组SBP、DBP和MAP均显著升高（P<0.05）。给药第3 w开始，与SHR组相比，SHR+QDG组SBP、DBP和MAP均显著降低（P<0.05）。同时，每周称量体重发现清达颗粒对大鼠体重无明显影响（P>0.05）。结果表明，清达颗粒降低自发性高血压大鼠血压且对体重无影响。见
图1 清达颗粒对自发性高血压大鼠血压和体重的影响
与WKY组相比
计算各组大鼠心脏重量指数，即心脏重量与胫骨长度的比值。与WKY组相比，SHR组心脏重量指数显著升高（P<0.05）；与SHR组相比，SHR+QDG组心脏重量指数显著降低（P<0.05）。结果表明，清达颗粒可以降低自发性高血压大鼠心脏重量指数。见
图2 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏重量指数的影响
与WKY组相比
灌胃8 w后，超声心动图显示，与WKY组相比，SHR组射血分数、短轴缩短率显著降低（P<0.05）；与SHR组相比，SHR+QDG组可以显著抑制射血分数、短轴缩短率的降低（P<0.05）。结果表明，清达颗粒可以改善自发性高血压大鼠心脏收缩功能。见
图3 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏功能的影响
与WKY组相比
心脏组织HE染色可发现，WKY组大鼠心肌纤维排列整齐；SHR组心肌纤维增粗肿胀、排列紊乱，心肌细胞束出现溶解断裂、炎性细胞浸润；SHR+QDG组可显著改善上述病理形态改变。结果表明，清达颗粒可以改善自发性高血压大鼠心脏病理形态的变化。见
图4 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏病理形态的影响（HE，400×）
经qRT-PCR和Westren Blot检测心脏组织ANP、BNP的表达发现，与WKY组相比，SHR组心脏组织ANP、BNP的mRNA和蛋白水平显著升高（P<0.05）；与SHR组相比，SHR+QDG组可显著降低ANP、BNP的mRNA和蛋白水平的表达（P<0.05）。结果表明，清达颗粒可以降低心肌肥厚基因ANP、BNP的mRNA和蛋白的表达。见图5-1及5-2。
图5-1 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏组织ANP、BNP mRNA的影响
与WKY组相比
图5-2 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏组织ANP、BNP 蛋白表达的影响
与WKY组相比
与WKY组相比，SHR组p-p38/p38蛋白表达显著升高（P<0.05）；与SHR组相比，SHR+QDG组p-p38/p38蛋白表达显著降低（P<0.05）。结果表明，清达颗粒可以抑制自发性高血压大鼠心脏p38 MAPK通路相关蛋白的活化。见
图6 清达颗粒对自发性高血压大鼠心脏组织p38 MAPK通路相关蛋白表达的影响
与WKY组相比
现代医学研究表明，高血压心脏病的特点是以心肌细胞的肥大和间质细胞的增殖为主，不仅使心肌细胞面积增大，而且激活肥厚基因，是心血管事件的独立危险因
丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控细胞增殖与肥
前期研究发现，清达颗粒对多种高血压动物模型作用显著，既可以降低血压，又可以保护高血压导致的靶器官损害，在改善高血压导致的心肌肥厚及心肌纤维化，抑制心室重构等方面疗效显
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