摘要
应用中药系统药理数据库（TCMSP）搜索天南星的活性成分，通过比较基因组学毒理数据库（CTD），筛选天南星的有效毒性成分，采用Swiss Targets Prediction数据库获得有效毒性成分的3D结构和毒性靶点，接着运用Cytoscape软件构建天南星的毒性成分、靶点和信号通路的关系网络和其Mcode插件筛选网络中的核心靶点，之后利用Metascape数据库进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，再利用Discovery Studio 2019 软件对核心毒性化合物和核心作用靶点进行分子对接和可视化，最后通过文献分析进一步验证毒性成分和靶点。
得到天南星有效毒性成分6种，作用靶点353个，核心靶点57个，GO细胞组分238条，分子功能245条，生物学途径2385条，KEGG信号通路40条，核心毒性成分1-乙酰-β-咔啉与核心毒性靶点结合良好。
天南星科属单子叶植物，全球计有115属2100 种，我国有35属206种，南北各省皆有分布，其中以云南省分布最为广
网络毒理学（network toxicology）是由刘昌孝院士首次提
TCMSP数据库 （https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）是基于系统药理学研究方法，包含了药物代谢动力学，药物化学和药物-靶标蛋白网络-疾病网络的中药系统药理学数据库分析平
以天南星为关键词在TCMSP数据库中搜索其活性成分，并设置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug like，DL）>0.1，获得天南星的有效成分，然后通过CTD数据库将TCMSP筛选出的有效成分进行查询，获得天南星的有效毒性成分。
有机小分子生物活性数据数据库PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）是美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）研发的数据库。该数据库收集了化学成分的化学结构，标识符，化学和物理性质等许多信息。Swiss Targets Prediction基于与已知化合物的二维和三维结构的相似性来预测化合物的靶标，以评估预测正确的可能性，还可对不同物种之间的同源性映射进行预测，并提供正确可能性得分。
将得到的有效毒性成分导入PubChem数据库从而获得有效毒性成分的3D结构，并将3D结构输入Swiss Targets Prediction数据库（http://swisstargetprediction.ch/），设置物种为人类，得到毒性靶点。
Cytoscape 源自系统生物学，用于将生物分子交互网络与高通量基因表达数据整合在一起，其最强大的功能是用于大规模蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA和遗传交互作用的分析。通过Cytoscape可在可视化下将生物网络与基因信息联系在一起。
获得天南星的有效成分及相应毒性靶点等信息后，运用Cytoscape 3.8.2软件构建“天南星核心毒性成分-毒性靶点”可视网络关系图，并计算各成分的度值，为分子对接筛选出最重要的核心毒性成分。
通过蛋白质相互作用数据库String （https://string-db.org/），可搜索已知蛋白质和预测蛋白质之间的相互作用。Mcode（Molecular Complex Detection）是Cytoscape软件中的一个插件，其可根据边和节点的关系，在网络中抓取出最关键的子网络和基因。
将天南星的毒性靶点导入String数据库，选择物种为人，设置最低作用评分为0.4，隐藏无链接的靶点，获得毒性靶点蛋白网络关系互作图，保存为TSV格式，导入Cytoscape 3.8.2，获得PPI网络。然后利用Mcode插件，对PPI网络进行分组，并对这些组团进行评分，选取评分最高的组团，抓取到网络中的关键靶点，并根据其度值设置靶点大小颜色，度值越高，靶点越大，颜色越深。
基因富集分析数据库Metascape（https://metascape.org/gp/）集合了四十多个生物信息数据库，主要包含生物通路富集分析，蛋白质互作用网络结构分析以及丰富的基因注释功能。基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析分为三大类：分子生物学功能（Molecular Function，MF）、生物学过程（Biological Process，BP）和细胞学组分（Cellular Components，CC），通过这三个功能大类，对一个基因的功能进行多方面的限定和描述。京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析数据库是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库，可将基因组信息和基因功能联系起来，揭示生命现象的遗传与化学基础。
将核心靶点导入Metascape数据库，通过输入靶点名称列表并限定物种为人，进行GO和KEGG富集分析，设置条件为P<0.05、最小富集值为1.5，并对其生物过程和代谢通路进行可视化，分析天南星发挥毒性参与的信号通路并探讨其可能的作用机制。
运用Cytoscape3.8.2软件，分析1.5中得到的KEGG代谢通路，根据Count值大小取排名前10的通路，将其与毒性作用靶点进行关联，构建毒性靶点-生物富集通路网络。
药物发现与生物大分子计算模拟软件（Discovery Studio）是专业的生命科学分子模拟软件，主要应用于蛋白质、抗体结构功能研究。
根据天南星有效毒性成分-靶点网络选取核心毒性成分，作为分子对接的配体，从天南星毒性靶点PPI网络中选取度值排名前9位的核心靶点作为分子对接的受体。将核心毒性成分输入Pubchem数据库以SDF格式保存其3D结构。将核心毒性靶点的CAS号输入PDB数据库，设置物种为人，优化分辨率为0-3.0Å，下载3D结构。使用Discovery Studio 2019将受体进行加氢、去水、模拟缺失环状区域，并预测结合口袋；将配体进行加氢，计算其同分异构体。利用CDOCKER模式预测核心化合物与核心靶点的潜在结合模式，计算CDOCKER相互作用能值，CDOCKER相互作用能越高，表示配体与靶蛋白的结合能力越
图1 天南星毒性预测流程图
通过TCMSP数据库共搜索到123种成分，设置OB≥30%和DL>0.1筛选得到有效成分19种，将19种有效成分与CTD数据库进行比对得到6种有效毒性成分：异油酸、亚油酸甲酯、1-乙酰基-β-咔啉、β-谷甾醇、豆甾醇、石竹烯氧化物。见
| 编号 | 化合物 | 分子式 | CAS号 | OB（%） | DL |
|---|---|---|---|---|---|
| TNX1 | 异油酸 | C18H34O2 | 3386-63-8 | 33.13 | 0.14 |
| TNX2 | 亚油酸甲酯 | C19H34O2 | 112-63-0 | 41.93 | 0.17 |
| TNX3 | 1-乙酰基-β-咔啉 | C13H10N2O | 50892-83-6 | 67.12 | 0.13 |
| TNX4 | β-谷甾醇 | C29H50O | 83-46-5 | 36.91 | 0.75 |
| TNX5 | 豆甾醇 | C29H48O | 83-48-7 | 43.83 | 0.76 |
| TNX6 | 石竹烯氧化物 | C15H24O | 1139-30-6 | 32.67 | 0.13 |
使用Swiss Target Prediction数据库预测和筛选作用靶点，同时利用Cytoscape 3.8.2软件进行网络构建，所得网络共359个节点，602条边，其中天南星的有效毒性成分由蓝色菱形表示，作用靶点由黄色椭圆形表示。其中度值较高的有效毒性成分包括1-乙酰基-β-咔啉、β-谷甾醇、豆甾醇。见
图2 天南星毒性成分-靶点网络图
构建天南星核心毒性靶点PPI网络，共57个节点，915条边，图中颜色越深，表示节点度值越高。度值排名前9位的靶点排序依次为APP、BDKRB2、CASR、ADORA1、ADORA3、ADRA2A、ADRA2B、CNR1、AVPR1A。见
图3 天南星毒性核心靶点图
将核心靶点输入Metascape数据库进行GO生物学分析，其中CC占比8.30%，BP占比83.16%，MF占比8.54%，其富集的生物学过程主要是G蛋白偶联血清素受体、神经细胞突触受体活性、细胞钙离子内稳态等生物活性（见
图4 GO生物学过程与KEGG代谢通路富集分析图
将2.4中排名前10位的KEGG信号通路（见
| 通路名称 | P值 | 基因数 |
|---|---|---|
| Neuroactive ligand-receptor interaction | 3.02606E-86 | 47 |
| Calcium signaling pathway | 4.9069E-28 | 19 |
| cGMP-PKG signaling pathway | 1.3761E-09 | 8 |
| Phospholipase D signaling pathway | 4.13407E-08 | 7 |
| Regulation of actin cytoskeleton | 2.38376E-07 | 7 |
| Sphingolipid signaling pathway | 1.45095E-07 | 6 |
| Gap junction | 2.50013E-08 | 6 |
| cAMP signaling pathway | 6.44446E-06 | 6 |
| inflammatory mediator regulation of trp channels | 5.96355E-05 | 4 |
| Serotonergic synapse | 0.000100694 | 4 |
图5 KEGG通路富集靶点图
选择天南星的核心毒性成分（1-乙酰基-β-咔啉）作为配体，核心毒性靶点（APP、BDKRB2、CASR、ADORA1、ADORA3、ADRA2A、ADRA2B、CNR1、AVPR1A）作为受体进行分子对接可视化。利用Discovery Studio 2019对受体蛋白进行活性对接口袋的预测，记录活性对接口袋如下：APP（X轴：25.734109，Y轴：-35.938035，Z轴：31.188924）、BDKRB2（X轴：106.358926，Y轴：-96.219292，Z轴：113.883499）、ADORA1（X轴：101.990773，Y轴：80.807354，Z轴：90.705972）、ADORA3（X轴：19.903953，Y轴：1.018343，Z轴：-19.830036）、ADRA2A（X轴：0.134400，Y轴：-7.362596，Z轴：-19.830036）、ADRA2B（X轴：111.956126，Y轴：100.000642，Z轴：105.612612）、CNR1（X轴：22.281918，Y轴：0.883720，Z轴：-8.921040）、AVPR1A（X轴：35.960270，Y轴：52.669794，Z轴：31.569711）、CASR（X轴：162.200417，Y轴：162.156925，Z轴：221.636717）。结果显示，1-乙酰基-β-咔啉能在预测的活性对接口袋中与核心毒性靶点紧密结合，其CDOCKER相互作用能见
| 毒性靶点基因 | PDB ID | CDOCKER相互作用能（KJ/mol） |
|---|---|---|
| APP | 3PMR | 22.491 |
| BDKRB2 | 7F20 | 23.311 |
| ADORA1 | 6D9H | 23.640 |
| ADORA3 | 7BBJ | 25.272 |
| ADRA2A | 6KUX | 26.235 |
| ADRA2B | 6K41 | 20.562 |
| CNR1 | 5U09 | 12.438 |
| AVPR1A | 1YTV | 28.485 |
| CASR | 7DTV | 27.699 |
图6 毒性靶点与1-乙酰-β-咔啉分子对接模式图
网络药理学通过建立药物-靶点、疾病-靶点之间的关系预测模型可分析药物在各网络模块中与特定节点之间的相互作用，但并不能全面且准确地体现药物的毒性靶
本研究通过CTD数据库比对毒性成分，预测毒性靶点，得到天南星的主要毒性成分为异油酸、亚油酸甲酯、1-乙酰基-β-咔啉、β-谷甾醇、豆甾醇和石竹烯氧化物；并获得潜在的毒性靶点353个，这些毒性靶点主要富集在1 -乙酰基-β-咔啉、β-谷甾醇和豆甾醇。研
本次研究中获取了天南星57个核心毒性靶点，其中度值较高的靶点依次为APP、BDKRB2、CASR、ADORA1、ADORA3、ADRA2A、ADRA2B、CNR1、AVPR1A。淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）是一种主要存在于神经元中的跨膜蛋白，β分泌酶可通过切割APP形成β-淀粉样蛋白肽斑块，从而诱导阿尔茨海默病的产
天南星的GO生物学过程和KEGG信号通路发现，其GO生物学过程主要包括突触膜（synaptic membrane）、血清素受体活性（serotonin receptor activity）、细胞钙离子稳态（cellular calcium ion homeostasis）等。研究表明，突触参与神经递质的合成和储存，是执行大脑活动的功能单
为进一步探究天南星主要的毒性成分1-乙酰基-β-咔啉与核心靶点APP、BDKRB2、CASR、ADORA1、ADORA3、ADRA2A、ADRA2B、CNR1、AVPR1A的结合模式，将1-乙酰基-β-咔啉与核心靶点进行分子对接，结果显示1-乙酰基-β-咔啉可通过氢键、烷基等与这些核心靶点的氨基酸残基紧密结合，通过CDOCKER半柔性对接发现1-乙酰基-β-咔啉分子与ADRA家族的CDOCKER相互作用能较高，其中ADRA2A是其家族中相互作用能最高的分子，而研究表明ADRA2A可调节大脑皮质的兴奋
综上所述，本研究采用网络毒理学的方法，对天南星的神经毒性机制进行了初步的探讨。天南星的主要毒性成分为1-乙酰-β-咔啉，神经活性配体受体相互作用信号通路参与了天南星的神经毒性作用，ADRA2A受体可能是天南星发挥神经毒性的核心作用靶点，其具体的毒性作用机制还需进一步验证。
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