摘要
将不同浓度的PS提取物作用于乳腺癌4T1细胞，通过CCK8法和集落形成实验检测PS提取物对细胞增殖的影响；通过Hoechst 33258细胞核染色法和Annexin V-FITC/PI染色法观察细胞凋亡情况；通过Western blot检测Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、CDK2、Cyclin A2蛋白表达，评估PS提取物对乳腺癌4T1细胞周期与凋亡相关蛋白表达的影响。
CCK8结果显示PS提取物各剂量组作用24、48、72 h后细胞存活率下降；不同浓度PS提取物处理4T1细胞后，细胞集落形成能力减弱；细胞周期检测结果表明PS提取物能阻滞细胞周期于S期；Hoechst 33258染色实验观察到细胞核固缩和出现明显的凋亡小体，Annexin V-FITC/PI染色流式细胞仪检测发现细胞凋亡率增加；Western blot结果显示PS提取物可使Bcl-2、周期蛋白Cyclin A2及CDK2表达降低，Bax、Cleaved caspase-3表达增加。
※基金项目 国家中医药管理局高水平中医药重点学科建设项目（No.国中医药人教函〔2022〕226号）
目前，乳腺癌(Breast Cancer)为全球影响女性死亡第二大原因的恶性肿瘤之
乳腺癌，又称“乳岩”，属“络病”范畴，起病于半表半里之间，与经络息息相关，其中，与肝、胃二经关系最为密切，治疗上宜着重从经络入手，使得由经络所成的结块从经络而
多功能酶标仪（瑞士TECAN公司）、LGC-12真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）、流式细胞仪（美国BD公司）、荧光倒置显微镜（德国Leica公司）、超高灵敏度化学发光成像系统（美国伯乐生命科学有限公司）、小型垂直电泳槽（美国伯乐生命科学有限公司）等。
丝瓜络（批号为B20121904-01，产地为湖北），购自河北楚风中药饮片有限公司；蒲公英（批号为210901，产地为安徽亳州），购自北京本草方源（亳州）药业科技有限公司。经福建中医药大学黄泽豪教授鉴定，分别为葫芦科植物正品丝瓜络和菊科植物正品蒲公英，且符合《中国药典》标准。
胎牛血清（批号：F8687）购自美国 sigma 公司；PBS磷酸盐缓冲液（批号：ISEQ00010）购自美国 Hyclone 公司；RMPI 1640 培养基（批号：C11875500BT）、0.25% EDTA 胰蛋白酶（批号：25200-056）均购自美国 Gibco 公司；胰蛋白酶（不含EDTA，批号：17H05A65）购自武汉博士德生物工程有限公司；青霉素/链霉素双抗溶液（100 ×，批号：C100C5）购自APExBIO；CCK-8试剂盒（批号：K1018）购自APExBIO；细胞周期与凋亡检测试剂盒（批号：C1052）、Hoechst 33258染色液（批号：C1018）均购自碧云天生物技术公司；Annexin FITC/PI凋亡检测试剂盒（批号：MA0220）购自大连美仑生物技术有限公司。β-actin抗体（货号：HRP-60008）、Bax抗体（货号：50599-1-1g）、Bcl-2抗体（货号：12789-1-AP）、CDK2（货号：10122-1-AP）、Cyclin A2（货号：66391-1-Ig）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；Cleaved caspase-3抗体（货号：9661S）购自美国CST有限公司。
称取100 g蒲公英与100 g丝瓜络中药饮片，浸泡30 min后，加入20倍蒸馏水煎煮30 min，过滤，重复两次，合并滤液，蒸发浓缩，冻干成粉末，取出称重，得率约为3.44%，放置于-20 ℃冰箱备用。
取对数生长期的4T1细胞，每孔100 μL（含5000个细胞），铺板至96孔板，并设置空白对照组（只含细胞的培养液），等到细胞贴壁。分别用0、12、24、48、96、192 μg/mL浓度的PS提取物处理24 h、48 h和72 h后，将CCK8工作液10 μL加至每个孔，在37 ℃下进行避光孵育2 h，用酶标仪测定450 nm下的吸收（A450nm），并计算出不同浓度下的抑制率。细胞抑制率(%)=(空白组-给药组)/(空白组-对照组)×100%。
4T1细胞以1×1
4T1细胞以1×1
4T1细胞以1×1
4T1细胞以1×1
4T1细胞以1×1
PS提取物不同剂量组作用24 h、48 h、72 h后4T1细胞存活率都降低，且随着药物剂量增大及作用时间增长，细胞抑制率增加，具有明显的剂量依赖性及时间依赖性。见
图1 PS提取物对4T1细胞抑制率的影响（n=5）
与对照组相比，不同浓度PS提取物干预后4T1细胞集落数均降低（P<0.01或P<0.001）。见
图2 PS提取物对4T1细胞集落形成的影响（n=3）
与空白对照组比较
与空白对照组相比，不同浓度PS提取物干预细胞后，细胞周期G1期细胞数均显著减少（P<0.01），S期细胞数目显著增加（P<0.01），G2期无显著变化。见
图3 PS提取物对4T1细胞周期的影响（n=3）
与空白对照组比较
不同浓度PS提取物干预4T1细胞48 h后，Hoechst 33258染色观察到空白对照组细胞的细胞核呈椭圆形，且颜色均匀，无明显凋亡小体产生；而不同剂量组中的细胞核均观察到不同程度的固缩、破碎、形状不一和明显的凋亡小体出现，且随着给药浓度的增加，凋亡小体也逐步增加，细胞的数量也逐渐降低。见
图4 PS提取物对4T1细胞凋亡的影响（200 ×）
A.空白对照组（0 μg/mL）；B.PS提取物（50 μg/mL）；C.PS提取物（100 μg/mL）；D.PS提取物（200 μg/mL）
Annexin V-FITC/PI染色结果如
图5 PS提取物对4T1细胞凋亡的影响（n=3）
与空白组比较
h后，随给药浓度的增大，细胞凋亡比率呈递增趋势，见
一般来讲，经脉可以贯通气血、沟通表里、贯通营卫
癌细胞的一个重要标志是具有无限增殖的能力，乳腺癌的发生受多种因素的影响，细胞增殖与凋亡的失控为其重要的影响因素。本研究通过CCK8检测及细胞集落形成实验发现，PS提取物对乳腺癌4T1细胞具有显著抑制作用，呈时间剂量依赖性，并可显著抑制细胞集落的形成，可知PS提取物具有抑制4T1乳腺癌细胞增殖的作用。癌症的发生与细胞周期之间的关系成为目前研究者们关注的重点，近几年来研究发现，可通过靶向调节细胞周期信号传导途径中的相关蛋白的方法进而来调节细胞周期的进程。本研究采用流式细胞仪检测发现，用不同剂量的PS提取物处理4T1细胞48 h后，G1期细胞数显著减少（P<0.01），S期细胞数目显著增加（P<0.01），G2期无显著变化，提示PS提取物可能是通过阻滞细胞周期的S期，从而影响4T1细胞增殖能力。S期是负责DNA复制和合成的重要阶段。S期停滞导致DNA复
细胞凋亡与细胞增殖有着密切的相关性，也是细胞增殖的重要影响因素之一，肿瘤可以通过诱导细胞凋亡的方式来进行治疗。细胞凋亡为多细胞生物为维持机体内稳态而形成的一种非炎症性的、主动死亡的过程，其受到多种基因和蛋白的表达和调
综上，PS提取物可能通过诱导小鼠乳腺癌4T1细胞凋亡和细胞周期S期阻滞，发挥抑制4T1细胞增殖的作用。此研究可为蒲公英-丝瓜络治疗乳腺癌提供重要的实验基础，也可为蒲公英-丝瓜络作用机制的研究及其开发利用提供新思路。
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