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养精颗粒对男性不育患者精子质量及精浆miR-424表达的影  PDF

  • 王志强 1
  • 朱晨 1
  • 王海 1
  • 陕文生 1
  • 孙大林 2
  • 金保方 2
1. 甘肃省妇幼保健院(甘肃 兰州 730050); 2. 东南大学附属中大医院(江苏 南京 210029)

最近更新:2023-03-25

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摘要

目的

探讨中药养精颗粒对男性不育患者精液质量及精浆微小核糖核酸424(miR-424)水平变化的影响。

方法

将90例特发性少弱精子症患者随机分为对照组和治疗组各45例,对照组口服天然维生素E胶囊,治疗组口服养精颗粒,两组均治疗3个月。观察两组治疗前后精液量、精子浓度、精子前向活力、精子DNA碎片指数(DFI)及精浆miR-424水平变化情况。

结果

与治疗前相比,治疗后对照组精子前向运动力及治疗组精液量、精子浓度、精子前向活力、精浆miR-424水平显著升高,治疗组DFI明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),且治疗组精液量、精子浓度、精子前向活力、精浆miR-424水平高于对照组,DFI低于对照组(P<0.05)。

结论

养精颗粒能提高不育患者的精液量、精子浓度、活力,降低精子DFI值,其对精子质量的影响可能与调节精浆miR-424水平有关。

不孕不育是一个重要的生殖健康问题,男性因素是导致不孕症发生的一半原因。既往对于男性生育力的评估主要依据精液常规、形态等分析,近年来有学者提出,精子DNA碎片化可能会对精子受精潜力产生不利影响,特别是当DNA损伤水平很高时是男性因素引起不孕不育的重要病[

1]。精子DNA完整性对于健康后代的出生是必不可少的,越来越多的证据表明,精子DNA碎片化是染色质受损的标志物,在男性不育和生殖助孕中具有独立和显著的作[2]。目前精子DNA损伤多为经验性治疗,如抗氧化剂或抗感染的药物治疗,而补肾生精的中药在此方面可能有一定的疗[3]。相关研[4]发现,精浆miR-424参与了精子DNA损伤,这种miRNA的失调可以诱导精子发生DNA双链断裂。本研究的目的是观察养精颗粒对精子质量的影响及可能作用机制的探讨。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2022年1月—2022年7月在甘肃省妇幼保健院男科就诊的90例患者,采用随机数字法分为对照组和治疗组各45例。对照组平均年龄(33.51±3.82)岁,平均精子浓度(7.91±2.53)×106/mL,平均精子前向运动(19.51±5.86)%。治疗组平均年龄(34.42±4.11)岁,平均精子浓度(7.72±2.41)×106/mL,平均精子前向运动(20.05±6.30)%。两组患者基础资料相比无统计学差异(P>0.05)。本研究通过医院伦理委员会批准(批号:〔2021〕GSFY伦理04号)。

1.2 诊断标准

参照2010年WTO的《人类精液检查与处理实验室手册[

5],精子密度每毫升<1500万为少精子症,精子前向活力<32%为弱精子症。

1.3 纳入标准

(1)1年以上未避孕、未育;(2)性生活规律;(3)精液分析至少进行两次,检查前需要禁欲2~7 d,符合少、弱精子症诊断标准;(4)配偶生育力基本正常;(5)患者签署知情同意书。

1.4 排除标准

(1)有隐睾史或患有睾丸炎者;(2)吸烟、酗酒或药物滥用,或最近3个月接受生育激素治疗的患者;(3)合并其他可能影响精子质量因素的患者,如肥胖、白细胞精子症、放化疗、核型异常或暴露于促性腺毒素的患者。

1.5 脱落标准

(1)受试者依从性差,不能坚持治疗者;(2)未按规定服药,无法判定疗效,或资料不全等影响疗效判定者。

1.6 治疗方法

1.6.1 对照组

予天然维生素E胶囊(浙江新昌制药厂,国药准字H33020187)口服,100 mg/次,3次/日。

1.6.2 治疗组

口服养精颗粒(组成:熟地黄10 g,黄精10 g,炙黄芪20 g,当归10 g,煅牡蛎20 g,王不留行10 g,荔枝核10 g,淫羊藿15 g,紫河车10 g,沙苑子10 g,炙水蛭10 g),由甘肃省妇幼保健院中药房提供,水煎服,2次/日,200 mL/次,饭后30 min服用。

两组患者的治疗周期均为3个月。

1.7 观察指标

于治疗前、治疗后进行观察。

1.7.1 精子质量

(1)精液常规:患者禁欲2~7 d,手淫取精,35 ℃恒温箱静置30 min或待液化后,以北京穗加精子检测系统CASAS-QH-III进行精液参数分析,采用WHO第5版推荐标准,测定精液常规参数。(2)精子DNA碎片指数(DFI):使用精子染色质结构分析法测量精子DNA损伤。该方法可以测量精子核DNA对原位酸诱导的DNA变性的敏感性。将先前冷冻于-80 ℃冰箱中的含有1×106精子的精液样品解冻,立即用含有0.1% Triton X-100,0.15 mol/L氯化钠和0.08 mol/L盐酸的洗涤剂溶液(pH 1.2)处理。30 s后,精子用含6 mg/mL吖啶橙(AO)的染色溶液在磷酸盐(pH 6)缓冲液中进行染色。BD流式细胞仪(Becton,Dickinson生物公司)用于分析染色细胞。对于每次测量,不低于5000个精子的荧光信号,用488 nm的光源激发细胞,导致吖啶橙插入产生绿色荧光的双链DNA,同时插入单链(变性)DNA。使用标准的贝克顿·迪金森软件,将每个精子的红色和绿色荧光坐标的强度值的原始数据绘制在一个散点图上。染色质结构异常的精子的百分比用DFI(%)表示。

1.7.2 精浆miR-424水平

用离心机3000 r/min离心精液8 min,再提取精浆上清液,在-20 ℃的冰箱中低温保存;采用RT-qPCR法检测精浆miR-424,采用公式2-△△ct来计算miR-424的相对表达含量。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析,计量资料采用t检验,以均数±标准差(x¯±s)表示;计数资料用χ2检验,采用百分比表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脱落情况

研究过程中两组均未出现脱落情况。

2.2 两组患者精子质量比较

治疗后,对照组精子前向运动力与治疗前相比显著增加,差异有统计学意义(P<0.05),精液量、精子浓度、DFI与治疗前相比,无显著改善(P>0.05)。治疗组治疗后精液量、精子浓度、精子前向活力与治疗前相比显著升高,DFI明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),且精液量、精子浓度、精子前向活力高于对照组,DFI低于对照组(P<0.05)。见表1

表1  两组患者治疗前后精子质量变化情况(x¯±s
观察指标对照组治疗组
治疗前治疗后治疗前治疗后
精液量(mL) 2.15±0.57 2.21±0.61 2.35±0.64 3.22±0.85*#
精子浓度(×106/mL) 7.91±2.53 8.23±2.53 7.72±2.41 12.84±5.12*#
精子前向活力(%) 19.51±5.86 28.51±5.86* 20.05±6.30 39.63±13.13*#
DFI(%) 36.62±2.68 30.17±2.03 37.35±3.01 14.46±4.57*#

注:  与本组治疗前比较*P<0.05;与对照组同期比较#P<0.05

2.3 两组患者精浆miR-424水平比较

治疗后,对照组精浆miR-424水平无明显变化(P>0.05),治疗组精浆miR-424水平显著升高(P<0.05)。治疗组治疗后的精浆miR-424水平高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2

表2  两组患者治疗前后精浆miR-424水平对比(x¯±s
组别治疗前治疗后
对照组 1.09±0.19 1.19±0.24
治疗组 1.13±0.21 2.82±0.33*#

注:  与本组治疗前比较*P<0.05;与对照组同期比较#P<0.05

3 讨论

男性不育的原因主要是精子质量的异常,临床上常表现为精子数量减少(少精子症)、精子活力下降(弱精子症)、精子形态异常(畸形精子症)以及精子DNA碎片损伤。有学者提出精子DNA损伤与辅助生殖技术如宫内授精率、体外受精率、卵胞浆内单精子注射率和复发性妊娠丢失率呈负相[

5],在评估体外受精-胚胎移植(IVF)成功率时,可将精子DNA损伤作为一个重要的参考指标,精子DNA损伤水平能预测辅助生殖助孕结[5]。因此,该技术可引进为实验室常规检查,可以丰富精液功能相关特征的诊断。精子质量下降有几种原因,包括精索静脉曲张、生活方式、职业和环境毒物、衰老和感染,但仍有大约40%的男性不育患者的病因尚不明[6]。针对精子异常的药物治疗,目前临床主要包括抗感染、抗氧化、激素、营养治疗[7],但效果不满意,缺乏特效药物,因此广大学者积极探索一种合理有效的药物治疗方案,并研究其可能的作用机制。

中医学关于男性不育多从肾、脾论治,认为“肾藏精,主生殖”,肾精充盛促使“天癸”成熟,在男子则表现为“精气溢泻”,能和阴阳而有子,若肾精衰少,肾气不足则“无子[

9]。因此,补肾填精药物治疗男性不育症历来为医家所重视,是改善精子质量的重要方法。近年来,随着与现代医学的交流日渐频繁,中医药在精子治疗方面也受到关[10-11]。张孝旭[12]研究发现,服用复方养精汤可以有效提高少弱精患者的精子质量,并改善患者的激素水平。

养精颗粒是由金保方教授的养精胶囊化裁而来,其理论来源于《黄帝内经》“肾藏精,主生殖”的思想,继承了“阳化气,阴成形”理论,由熟地黄、黄精、炙黄芪、当归、煅牡蛎、荔枝核、王不留行、淫羊藿、紫河车、沙苑子、炙水蛭等组成。方中淫羊藿可补肾助阳通脉,填精益髓;熟地黄具有补血、滋阴、益精之功,两药合用,既补肾阳,又补肾阴,共为君药。黄精具有补气养阴、填精益髓之效;沙苑子具有补肾固精、温阳补虚之功;黄芪、当归具有气血双补、强五脏、补肾气的作用;紫河车乃血肉有情之品,可加强补肾填精、益气养血之功,共为臣药。王不留行、炙水蛭具有活血通经脉之功;煅牡蛎可补肝肾之阴,固肾涩精;荔枝核入肝、肾经,具有温中理气之效,共为佐药。诸药共奏补肾益精养血,滋阴温阳之功效。

精子质量异常发病因素众多,其中遗传因素是重要的发病因素之一,且精子质量越差与遗传因素的相关性越[

13],目前,miRNAs正被用作非侵入性诊断的生物标志物。miRNAs是单链非编码RNA分子,通过抑制或抑制翻译作为转录后基因沉默调节因子,在几种不同类型的男性不育症中,人们已经研究了miRNA调控的变化,因此已经确定了miRNA和靶点基因在精子发生过程中的生物学作用。精原细胞干细胞(SSCs)是精子发生和男性生育能力所必需的,Wang[14]研究认为miR-424调控SSCs的自我更新,功能分析显示,miR-424对SSCs的自我更新至关重要。Chen[15]研究发现,在不育男性中miR-424的下调可能通过直接作用于靶基因位点Ddx3x,诱导生精细胞凋亡和精子DNA损伤,导致男性不育。这可能是养精颗粒改善精子质量异常的重要机制之一。

综上,本研究发现养精颗粒可以改善特发性少弱精子症患者的精液参数,降低精子DNA的损伤程度,调节精浆miR-424水平,说明该治疗方案是有效的。本研究也存在一定的局限性,如样本量较小、无安慰剂组等,以及缺乏养精颗粒通过调节精浆miR-424改善精子质量作用机制的基础实验研究,仍有待进一步深入探索。

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