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电针通过增强突触可塑性改善抑郁样小鼠社交与空间记忆能力作用研  PDF

  • 黄志源
  • 谢彦颖
  • 马增明
  • 朱传安
厦门市仙岳医院(福建 厦门 361012)

最近更新:2024-05-17

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摘要

目的

观察电针百会、印堂对抑郁样小鼠社交与空间记忆能力的影响。

方法

将48只SPF级雄性C57/BL6小鼠随机分为对照组、模型组、电针组、氟西汀组各12只,采用慢性不可预见性温和性应激制备抑郁样小鼠模型,电针组给予电针百会穴、印堂穴(连续波,2 Hz,1 mA,30 min/d),氟西汀组给予10 mg/kg氟西汀,每日干预1次,连续干预10 d。使用糖水偏好实验、强迫游泳实验、悬尾实验、三箱社交实验、Y迷宫实验评估各组小鼠抑郁行为、社交能力及空间记忆,使用离体电生理技术记录小鼠海马场电位,评估各组小鼠突触可塑性。

结果

与对照组比较,模型组小鼠糖水消耗、社交时间、Y迷宫新奇臂进入次数与探索时间、fEPSP斜率均明显降低(P<0.01),强迫游泳与悬尾实验不动时间均显著增加(P<0.01)。与模型组比较,电针组、氟西汀组小鼠糖水消耗、社交时间和Y迷宫新奇臂进入次数及探索时间、fEPSP斜率均明显增加(P<0.05或P<0.01),强迫游泳与悬尾实验不动时间均显著减少(P<0.05或P<0.01)。与氟西汀组比较,电针组小鼠糖水消耗、悬尾实验不动时间、fEPSP斜率均明显降低(P<0.05),强迫游泳不动时间、社交时间和Y迷宫新奇臂进入次数及探索时间均无明显改变(P>0.05)。

结论

电针能够改善小鼠抑郁样行为,并且可以改善海马突触可塑性,改善小鼠社交能力与空间学习记忆。

抑郁症(depression)是一组以长期心境低落、愉快感缺乏、精力减退为主的常见精神障碍,全球每年约有5%的人患有抑郁症,而在中低收入国家更是高达80%~90%,且75岁时的抑郁症平均发病风险预计为19.6%,抑郁症已然成为世界范围内主要致残原因,也是全球疾病总负担的主要原[

1]。抑郁症除了情绪方面的改变,其社交能力与记忆认知功能也伴有不同程度的降[2]。研究报道,针刺可以有效改善阿尔茨海默病、血管性痴呆患者的学习记忆能力,提高患者生活质[34],可能是通过改善突触可塑性,提高海马长时程增强(long-term potentiation,LTP)来实现[56]。那么针刺能否通过改善抑郁样小鼠的LTP来改善其社交与空间记忆能力,目前尚未报道。本研究拟采用慢性不可预见性温和性刺激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)制备小鼠抑郁样模型,通过电针百会穴、印堂穴观察电针对抑郁样小鼠社交与空间记忆能力的影响,并探讨其可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

48只6~7 w龄SPF级雄性C57/BL6小鼠购于厦门大学实验动物中心,动物许可证号:SCXK(闽)2018-003。饲养环境:每笼4只小鼠,12 h/12 h光暗周期,温度(22±2) ℃。实验前将其适应性饲养1 w,随机分为对照组、模型组、电针组、氟西汀组各12只。所有操作均严格遵守厦门市仙岳医院实验动物管理伦理审查委员会的规定,符合动物实验行为规范(批准文号:2022-KY-013)。

1.2 主要试剂和仪器

盐酸氟西汀分散片(Patheon France,20 mg),异氟烷(麦克林,I833358-250 g)。

一次性无菌针灸针(中研太和,0.16 mm×7 mm)、实验动物麻醉呼吸机(瑞沃德,R58S)、刺激器(BMS-master-9)、小动物行为学检测系统(Stoeling,ANY-maze version 4.99 m)、震动切片机(Leica,VT1000S)、CMOS相机(HAMAMATSU,C11440-36U)、放大器(Axon Instrument, Multiclamp 700B)、数模转换器(Axon Instrument,1550B)、微电极拉制仪(Sutter, P-1000)。

1.3 动物模型制备

采用CUMS方法制备抑郁模[

7],模型组、电针组、氟西汀组连续造模21 d,其间小鼠每天随机给予以下不同应激:①束缚1 h;②无垫料饲养2 h;③禁食禁水15 h;④明暗时间紊乱24 h;⑤潮湿垫料饲养18 h;⑥笼子倾斜2 h。造模期间对照组小鼠常规饲养。

1.4 干预方法

小鼠“百会”“印堂”两穴定位参照《小鼠常用针灸穴位[

8]。CUMS造模结束后,对电针组小鼠给予电针干预。异氟烷麻醉小鼠后,针刺百会穴、印堂穴约5 mm,连接至Master 9脉冲刺激器(连续波,2 Hz,1 mA),30 min/d,共10 d。电针期间其余组小鼠仅以相同方式麻醉,无电针干预。

氟西汀干[

9]:给予氟西汀组小鼠10 mg/kg灌胃治疗,每日1次,连续10 d。其余组小鼠给予等量溶剂(水)。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 糖水偏好实验

干预结束后第1~3 d依照参考文[

10]进行检测:每只小鼠单笼饲养,第1 d给小鼠1瓶1%的蔗糖水与1瓶纯水,自由饮食饮水;第2 d,给小鼠饮用2瓶1%蔗糖水;第3 d,小鼠禁水16 h,之后给予1瓶纯水,1瓶2%蔗糖水,记录24 h消耗量,12 h后调换两瓶的位置。计算蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+水消耗量)×100%评估小鼠对糖水的偏好。

1.5.2 三箱社交实验

干预结束后第4 d,依照参考文[

11]进行检测。三箱中两端箱子对角处放入2个倒置的金属丝网杯,小鼠放入中间箱自由探索5 min。之后将一只同龄同性别小鼠放入金属丝网杯中作为社交鼠,待测小鼠放入中间箱自由探索10 min,记录与社交鼠接触的时间。

1.5.3 Y迷宫实验

干预结束后第5 d,依照参考文[

12]进行检测。关闭新奇臂,将小鼠从起始臂末端放入,自由探索起始臂和其他臂15 min。结束后间隔90 min,打开新奇臂,将小鼠从起始臂末端放入,自由探索三个臂5 min,记录实验小鼠进入新奇臂的次数和时间。

1.5.4 强迫游泳实验

干预结束后第6 d,依照参考文[

10]进行检测。将小鼠放入装有20 cm深的水(24±2) ℃的透明塑料圆筒中,强制游泳6 min,记录后4 min不动时间。

1.5.5 悬尾实验

干预结束后第7 d,依照参考文[

13]进行检测。将胶带贴在小鼠尾部距末端2 cm处,并将小鼠悬吊在30 cm高的水平杆上,悬吊6 min,记录小鼠后4 min不动时间。

1.5.6 电生理记录

干预结束后第8 d,依照参考文[

14]进行检测。小鼠麻醉后快速取脑,制备脑片,厚度为300 μm,32 ℃水浴孵育30 min,常温孵育1 h,整个过程中人工脑脊液(包含氯化钠120 mmol/L,氯化钾2.5 mmol/L,二水合磷酸二氢钠1.2 mmol/L,碳酸氢钠26 mmol/L,D-葡萄糖10 mmol/L,二水合氯化钙2 mmol/L,硫酸镁2 mmol/L,pH 7.35~7.45,渗透压290~310 mOsm)中始终通入95% O2与5% CO2混合气体。LTP 由高频刺激诱导(100 Hz),高频刺激之前记录10 min基线,然后记录高频刺激诱发的兴奋性突触后电位(fEPSPs),记录60 min。分析高频刺激后的斜率值与基线的百分比变化。

1.6 统计学方法

采用 Python 3.7对实验数据进行分析及统计作图。计量资料以(x¯±s)表示。数据符合正态分布及方差齐性,采用单因素方差分析法对数据进行分析,两两比较采用Bonferroni事后检验法进行分析。经校正后不符合正态分布及方差齐性,数据采用非参数检验。所有统计结果以检验统计量α=0.05为显著性检验标准。

2 结果

2.1 各组小鼠抑郁相关行为学比较

与对照组比较,模型组、电针组小鼠糖水消耗均明显减少(P<0.01),强迫游泳与悬尾实验不动时间均明显延长(P<0.01);氟西汀组小鼠糖水消耗无明显改变(P>0.05),强迫游泳与悬尾实验不动时间均明显缩短(P<0.01)。与模型组比较,电针组、氟西汀组小鼠糖水消耗均明显增加(P<0.01),强迫游泳与悬尾实验不动时间均明显缩短(P<0.05或P<0.01)。与氟西汀组比较,电针组小鼠糖水消耗明显减少(P<0.05),悬尾实验不动时间明显延长(P<0.01),强迫游泳不动时间无明显改变(P>0.05)。见图1

图1  电针对小鼠抑郁相关行为学的影响

与对照组比较*P<0.05**P<0.01;与模型组比较#P<0.05##P<0.01;与氟西汀组比较&P<0.05&&P<0.01

2.2 各组小鼠社交与空间记忆相关行为学比较

与对照组比较,模型组小鼠社交时间明显减少(P<0.01),Y迷宫中进入新奇臂的次数与时间均明显减少(P<0.01);电针组与氟西汀组小鼠社交时间、Y迷宫中进入新奇臂的次数与时间无明显改变(P>0.05)。与模型组比较,电针组、氟西汀组小鼠社交时间均明显增加(P<0.05),Y迷宫中进入新奇臂的次数与时间均明显增加(P<0.05或P<0.01)。与氟西汀组比较,电针组小鼠社交时间、Y迷宫中进入新奇臂的次数与时间无明显改变(P>0.05)。见图2

图2  电针对小鼠社交与空间记忆相关行为学的影响

与对照组比较**P<0.01;与模型组比较#P<0.05##P<0.01

2.3 各组小鼠LTP比较

与对照组比较,模型组、电针组小鼠fEPSP斜率均明显减少(P<0.01);氟西汀组小鼠fEPSP斜率无明显改变(P>0.05)。与模型组比较,电针组与氟西汀组小鼠fEPSP斜率均明显增加(P<0.01)。与氟西汀组比较,电针组小鼠fEPSP斜率明显减少(P<0.01)。见图3

图3  电针对小鼠LTP的影响

与对照组比较**P<0.01;与模型组比较##P<0.01;与氟西汀组比较&&P<0.01

3 讨论

抑郁症可归属于中医学“郁证”的范畴,常由情志所伤导致气机郁滞,脏腑功能失调,进而出现情绪低落、情志不舒、善太息等表现,为中医学常见的情志病之[

15]。现代研[16]发现,来源于生活、学习、工作的慢性应激在抑郁症、焦虑障碍发病中发挥着重要作用,同时也是睡眠障碍、精神分裂症、双相情感障碍等精神心理疾病的重要发病因素。CUMS是模拟慢性应激制备抑郁症的经典方法,CUMS后动物表现出运动能力降低、精神萎靡,欣悦、快感缺乏等类似人类抑郁症状,能够较为真实地模拟抑郁症患者的某些病因和症状,是比较理想可靠的抑郁动物模[17]。本研究发现,CUMS后模型组小鼠快感降低,主要表现为糖水消耗减少,运动及认知功能损伤,社交、空间记忆能力的显著降低,与临床抑郁症患者的表现较为相[18]

头为诸阳之会,脑为元神之府,情志病的发病与脑密切相关。“督脉入络脑”,与脑直接相关联,通过刺激本经上的腧穴能够达到调节本经及相交会经络的经气从而调控大脑功能,故有通督调神之[

19]。百会穴位于督脉,同时又位于巅顶之处,为百脉交会之穴,具有醒脑开窍、安神定志、通督定痫之[20]。印堂穴位于头面部、两眉头之间,同时也位于督脉,具有安神定惊、疏风止痛、醒脑通窍的功[21],两穴合用共奏通督调神之效。研究发现,电针百会穴、印堂穴能够通过提高突触可塑性而有效改善母婴分离后抑郁样大鼠学习记忆能力,减少水迷宫寻找平台的潜伏[22],同时还能增加慢性应激所致焦虑样小鼠旷场中央区探索时间、高架十字迷宫开臂探索次数与时间,减轻小鼠焦虑样行[23]

LTP的发生是由于短时间内强去极化电位激活了更多的NMDA型谷氨酸受体,从而使蛋白质磷酸化增强,促使钙离子大量流入突触后神经元,因而产生较强的兴奋性突触后电位,与突触可塑性密切相关,后者可直接反映学习记忆情况,因此LTP被认为是学习与记忆的主要分子机制之[

24]。抑郁症往往会表现为突触前兴奋性递质释放减[25],同时海马LTP受损,表现出学习记忆能力的降低,水迷宫实验中潜伏期延[22],Y迷宫中表现出空间学习记忆受[26],其可能与氧化应[2728]、炎[26]相关,而改善受损的LTP能够改善动物抑郁样行为及学习记忆能[22]。氟西汀作为临床一线抗抑郁药物,其能够提高细胞兴奋[7],抑制突触间5-羟色胺(5-HT)再摄取,增加突触间5-HT浓度,增强神经可塑性,从而产生抗抑郁作[9]。本研究发现电针百会、印堂两穴能够改善海马突触可塑性。因此,本研究表明电针百会、印堂两穴可以改善小鼠抑郁样行为,同时改善小鼠社交及空间学习记忆能力,可能与电针能够降低氧化应[23]、减轻炎[29]、增强LTP[22]等相关。

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