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基于网络药理学和分子对接探讨威灵仙-牛膝药对治疗类风湿关节炎的作用机制  PDF

  • 费陈晨 1
  • 谌曦 2 ✉
  • 杨凯 1
  • 万磊 2
  • 范海霞 2
  • 刘天阳 2
  • 李明 2
  • 刘磊 2
  • 葛瑶 2
  • 王晴晴 1
  • 范文杰 1
  • 周倩 1
1. 安徽中医药大学第一临床医学院（安徽 合肥 230038）； 2. 安徽中医药大学第一附属医院（安徽 合肥 230031）

最近更新：2022-11-09

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摘要

目的

基于网络药理学及分子对接技术，探讨威灵仙-牛膝药对有效活性成分、潜在靶点及其治疗类风湿关节炎（RA）的作用机制。

方法

TCMSP数据库检索威灵仙-牛膝药对活性成分及作用靶点，GeneCards、DisGeNET数据库检索RA相关靶点，得出交集靶点，运用Cytoscape 3.7.1软件，构建“疾病-药物-有效成分-靶点”网络图，构建PPI网络并进行GO和KEGG分析，并运用Auto Dock软件进行分子对接。

结果

得到威灵仙-牛膝药对有效活性成分19个，对应靶点94个，RA相关靶点5589个，交集靶点72个；主要作用靶标有CAS P3、TP 53、CCND1等；涉及PI3K-Akt、MAPK及p53通路等。

结论

本研究以网络药理学和分子对接技术为基础，阐明了威灵仙-牛膝药对通过多成分、多靶点、多通路治疗RA的作用机制。

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种侵犯滑膜、软骨组织的全身性、系统性、自身免疫性疾病，可导致关节畸形[

1-3]及心、肺、肾等器官的严重并发症。RA的发病机制较为复杂，涉及多个生物过程，包括炎症因子释放和信号通路的转导等，但针对其机制研究尚不够完善。目前RA常用治疗药物包括糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂等，但长期应用的不良反应较多，因此中医药在RA治疗中尤为重要。

中医上本病属于“痹证”“尪痹”“历节风”等范畴，其病因不外乎正气亏虚，风寒湿热等外邪侵袭机体，痹阻气血经络，不通则痛[

4]。威灵仙可祛风湿、通经络，牛膝可活血化瘀、补益肝肾、强筋骨，两药配伍共奏祛风通络之效，主治风寒湿痹。两药的临床疗效确切，但介于其化学成分复杂及药物间可能会产生相互作用，其靶点乃至作用机制方面的研究受到限制。目前网络药理学在中药研究方面成果显著，通过构建网络图，可预测药物潜在靶点与作用机制。因此，本研究以网络药理学和分子对接技术为基础，探讨威灵仙-牛膝药对有效活性成分、潜在靶点及其治疗RA的作用机制，为进一步临床实验与治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1　相关数据库及平台

中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Databaseand Analysis Platform，TCMSP)（https://old.tcmsp-e.com/）、GeneCards(Version 5.10)(https://www.genecards.org/)、DisGeNET（v 7.0）(https://www.disgenet.org/home/)、Uniprot通用蛋白数据库(https://www.uniprot.org/)、网络图像化软件Cytoscape 3.7.1(http://cytoscape.org/)、String在线(Version:11.5)(https://cn.string-db.org/)、AutoDockTools-1.5.7（https://autodock.scripps.edu/）、pymol-2.4.0（Python Extension Packages for Windows-Christoph-Gohlke)、OpenBabel 3.0.0（http://openbabel.org/wiki/Main_Page）

1.2　药物有效成分及作用靶点的筛选

以“威灵仙-牛膝”药对为关键词，通过TCMSP数据库筛选药对活性成分及作用靶点，筛选条件为口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18。

1.3　疾病RA相关靶点的检索

以“rheumatoid arthritis”为关键词，通过GeneCards、DisGeNET数据库检索疾病相关靶点，将所得数据导入Uniprot数据库进行基因标准化处理。

1.4　药物-疾病共同靶点预测及网络构建

将所得的药物靶点与疾病靶点相匹配，筛选出交集靶点。通过Cytoscape分析上述所有信息，构建“疾病-药物-有效成分-靶点”网络图并进行网络特征分析。

1.5　PPI网络构建和相关靶点筛选

将疾病与药物的交集靶标基因导入String数据库，利用Cytoscae软件进行分析，构建疾病、药物靶标蛋白质相互作用（PPI）网络，预测靶标蛋白相互作用关系。

1.6　GO分析和KEGG通路分析

利用String数据库对药物-疾病的共同靶点基因进行GO功能分析和KEGG信号通路富集分析，并通过R语言绘制条形图和气泡图，根据富集因子值分析核心通路富集程度。

1.7　核心有效成分与核心靶点的分子对接

将“疾病-药物-有效成分-靶点”网络中的基因靶点Degree进行降序排列，筛选出威灵仙-牛膝药对前5位有效成分及核心靶点，在RSCB PDB数据库中选择相应基因靶点蛋白结构并下载，在TCMSP及Pubchem数据库获取有效成分的结构并下载，再用Open Babel转换成相应的文件格式。通过Auto Dock软件将靶点蛋白和小分子配体进行对接处理，Pymol进行数据可视化。

2 结果

2.1　威灵仙-牛膝药对活性成分及靶点的筛选

TCMSP数据库筛选出威灵仙有效成分7个，其中4个无对应靶点予以剔除；牛膝有效成分20个，其中3个无对应靶点予以剔除。共得到威灵仙-牛膝药对活性成分19个（见表1，其中β-谷甾醇为两药的共同活性成分），对应靶点94个。

表1  威灵仙-牛膝活性成分
序号分子编码化合物名称来源药物
1 MOL000358 beta-sitosterol（β-谷甾醇） 威灵仙、牛膝
2 MOL000449 Stigmasterol（豆甾醇） 威灵仙
3 MOL005603

Heptyl phthalate

（邻苯二甲酸庚酯）

威灵仙
4 MOL001006 poriferasta-7,22E-dien-3beta-ol（菠菜甾醇） 牛膝
5 MOL012461 28-norolean-17-en-3-ol 牛膝
6 MOL001454 Berberine（黄连素） 牛膝
7 MOL001458 Coptisine（黄连碱） 牛膝
8 MOL000173 Wogonin（汉黄芩） 牛膝
9 MOL002643

delta 7-stigmastenol

[δ(7)-豆甾烷醇]

牛膝
10 MOL002714 Baicalein（黄芩素） 牛膝
11 MOL002776 Baicalin（黄芩苷） 牛膝
12 MOL002897 Epiberberine（表小檗碱） 牛膝
13 MOL003847 Inophyllum E（顺反式叶黄内酯） 牛膝
14 MOL000422 Kaempferol（山奈酚） 牛膝
15 MOL004355 Spinasteroll（菠菜甾醇酯） 牛膝
16 MOL000449 Stigmasterol（豆甾醇） 牛膝
17 MOL000785 Palmatine（巴马亭） 牛膝
18 MOL000085

beta-daucosterol-qt

（β-胡萝卜甾醇）

牛膝
19 MOL000098 Quercetin（槲皮素） 牛膝

2.2　威灵仙-牛膝药对治疗RA关键靶点的筛选

采用GeneCards、DisGeNET数据库检索RA相关靶点，uniprot进行基因标准化，共得到疾病靶点基因5589个，匹配药物靶点与疾病靶点，筛选出交集靶点72个。

2.3　药物-疾病相关靶点的网络构建

将所筛选的活性成分及相关靶点导入Cytoscape软件，构建“疾病-药物-有效成分-靶点”网络图（见图1），并进行网络特征分析。该图共有109个节点，652条边。三角形节点代表RA，菱形节点代表威灵仙-牛膝，六边形节点代表有效活性成分，八边形节点代表靶点，边线代表药物、疾病、有效活性成分与靶点之间的相互关联，图形大小与节点数量呈正相关。根据Degree值高低筛选出前10个核心有效成分(见表2)以及前30个靶点基因（见表3）。结果显示，槲皮素、山奈酚、黄芩素、汉黄芩素为节点值较高的活性成分，说明其在治疗RA中发挥至关重要的作用。

图1  “疾病-药物-有效成分-靶点”网络图

表2  威灵仙-牛膝核心有效成分
序号分子编码化合物名称Degree值
1 MOL000098 槲皮素 75
2 MOL000422 山奈酚 35
3 MOL002714 黄芩素 25
4 MOL000173 汉黄芩素 23
5 MOL000449 β-谷甾醇 19
6 MOL000358 豆甾醇 16
7 MOL001454 小檗碱 9
8 MOL000785 黄藤素 9
9 MOL002897 表小檗碱 7
10 MOL001458 黄连碱 5
表3  网络构建中核心靶点基因
序号基因名称Degree序号基因名称Degree值
1 NCOA2 12 16 AHR 5
2 PTGS1 12 17 NCOA1 4
3 AR 10 18 CHRM3 4
4 PRSS1 9 19 CASP9 4
5 RXRA 8 20 AHSA1 4
6 GABRA1 7 21 HIF1A 4
7 ESR1 7 22 CCNB1 4
8 BCL2 7 23 F7 4
9 CASP3 7 24 CTRB1 3
10 CALM1 6 25 PDE10A 3
11 PPARG 6 26 GSK3B 3
12 CHRM1 5 27 CCND1 3
13 CHRM2 5 28 EIF6 3
14 RELA 5 29 IL6 3
15 TP53 5 30 VEGFA 3

2.4　PPI网络构建与分析

交集靶标基因导入String数据库，利用Cytoscape软件构建PPI网络,并分析结果，预测靶标蛋白相互作用关系。其中包含82个节点，1974条边，节点颜色深浅与节点数目呈正相关。使用Cytoscape软件处理数据（见图2）并根据Degree值高低筛选出前20个核心靶点基因（见表4）。

图2  PPI网络互作图

表4  PPI网络中核心靶点基因
序号基因名称Degree值序号基因名称Degree值
1 CASP3 47 11 NFKBIA 38
2 TP53 47 12 FN1 38
3 CCND1 45 13 CASP8 35
4 HIF1A 45 14 SIRT1 35
5 VEGFA 45 15 ICAM1 33
6 MYC 45 16 ERBB2 33
7 IL6 43 17 HMOX1 33
8 EGF 40 18 RELA 32
9 ESR1 39 19 MAPK8 31
10 PPARG 39 20 CYCS 31

2.5　GO分析和KEGG通路分析

应用String数据库将筛选出来的威灵仙-牛膝药对和RA的共同靶点72个，进行GO和KEGG富集分析，设定标准为P<0.05，共得到生物过程238条。其中GO分析得到106条，前20条结果如图3所示，主要涉及DNA结合转录因子（DNA-binding transcription factor binding）、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子（RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding）、转录协同调节因子（transcription coregulator binding）、泛素样蛋白连接酶（ubiquitin-like protein ligase binding）等过程。KEGG分析得到132条，前20条与RA密切相关的通路如图4所示，圆点越大颜色越深，提示该通路富集的靶点越多，P值越小，主要富集的信号通路涉及脂质与动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）,流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）、化学致癌-受体激活（Chemical carcinogenesis-receptor activation）等。

图3  核心靶点的GO分析

图4  核心靶点的KEGG分析

2.6　核心有效成分与核心靶点的分子对接

根据“疾病-药物-有效成分-靶点”网络中交集靶点的Degree值选择威灵仙-牛膝药对核心活性成分槲皮素、山奈酚、黄芩素、汉黄芩素、β-谷甾醇与核心靶点CASP3、TP53、CCND1、HIF1A、VEGFA进行分子对接，其中槲皮素、山奈酚与核心靶点CASP3、CCND1具体对接过程见图5。对接结果说明威灵仙-牛膝中活性成分与RA关键核心靶点基因有着良好的结合作用。

A  

B  

C  

图5 核心有效成分与核心靶点的分子对接

3 讨论

RA以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现，基本病理改变为滑膜炎，血管翳形成，逐渐出现软骨和骨的破坏，造成关节畸形和功能丧失，严重影响患者的生活质量。目前中药治疗RA取得良好疗效，威灵仙-牛膝则为临床中的典型药对，但是有关其作用机制及靶点的研究尚不清楚。

传统中医药治疗疾病提倡“人体即一个整体”以及“天人合一”，而网络药理学通过构建“药物-靶点-疾病”网络，探索网络各节点生物功能与疾病的互作关系，这与中医的整体观不谋而合。目前网络药理学已成为中医药药理基础与作用机制研究的热门工具，广泛应用于中药活性成分筛选、药物重定位、中药配伍机制探索及中医药多成分、多靶点、多通路的作用机制阐释等。

本研究运用Cytoscape软件，构建“疾病-药物-有效成分-靶点”网络图，结果显示槲皮素、山奈酚、黄芩素、汉黄芩素为威灵仙-牛膝药对治疗RA的有效活性成分。槲皮素在治疗RA方面取得了良好的临床疗效[

5]，可以抑制滑膜血管翳的形成，抑制中性粒细胞外诱捕网（NETS）的形成，通过抑制NF-κB通路，抑制金属蛋白酶MMP-13的表达，减少IL-6等炎症因子的释放，改善关节肿胀，达到治疗RA的目的[6]。山奈酚可通过下调miR-146a，沉默Decorin，使PI3K/AKT/mTOR通路处于过表达状态，从而达到抗骨关节炎的作用，其还可通过抑制脂多糖（LPS），降低Caspase-1和Caspase-3的活化水平，减少促炎因子IL-6、IL-8、TNF-a的释放，从而减轻炎症损伤[7]。黄芩素对胶原诱导型关节炎小鼠（CIA）有一定治疗作用，可以减轻滑膜增生、延缓骨质破坏和降低外周血中炎症因子释放[8]。汉黄芩素可抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLS）的增殖并诱导其凋亡，通过下调促炎因子IL-6，降低VEGF的表达水平，抑制血管翳的形成，减轻关节破坏[9]。

PPI网络分析结果显示，前十位的核心靶点基因为CASP3、TP53、CCND1、HIF1A、VEGFA、MYC、IL-6、EGF、ESR1、PPARG。目前研究发现，Caspase3抑制剂可阻断TNF诱导的单核细胞和巨噬细胞的焦亡，有效缓解CIA小鼠模型的关节炎[

10]。上调lncRNA GAS5，可抑制PI3K/AKT信号通路的活化水平，增强caspase-3、caspase-9的表达，抑制RA-FLS的增殖，减轻关节炎症[11]。TP53除了是一种肿瘤抑制因子外，还是一种炎症抑制因子，涉及多个细胞生物过程，与自身免疫性疾病密切相关。MDM2为TP53的关键调控因子，在RA-FLS中高表达，可通过MAPK和NF-κB信号通路影响TNF-α、IL-6等炎症因子的释放，调节炎症状态，其抑制剂具有抗炎活性，可能成为治疗RA的新靶点[12]。CCND1的过表达可以抑制软骨细胞自噬，促进骨关节炎中的软骨细胞增殖，主要作用机制包括SNHG16调控的microRNA-93-5p/CCND1轴[13]、circRHOT1调控的miR-142-5p/CCND1轴[14]等。目前研究发现，MDM2del1518变异与RA之间存在相关关系[15]。HIF1A是一种缺氧诱导因子，主要依赖的糖酵解途径协调TH17和Treg细胞分化，HIF1A的缺失，可下调TH17，上调Treg，保护小鼠免受自身免疫性神经炎症[16]。VEGF的表达主要受相关转录因子、炎症因子等的影响，通过降低IL-1β、IL-6及TNF-α的水平，可抑制VEGF的过表达，抑制滑膜血管翳的形成，治疗RA[17]。研究发现，VEGE的水平与RA发病密切相关，可作为评估RA疾病活动新标志物[18]。IL-6在RA的发病中发挥着至关重要的作用，使成骨与破骨细胞之间的平衡失调，诱发骨质疏松[19]。靶向IL-6慢病毒介导RNA干扰的体外、体内试验，在CIA模型中取得良好疗效，可作为RA的新型靶向基因治疗[20]。

GO和KEGG富集分析结果显示，威灵仙-牛膝药对通过DNA结合转录因子、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子、转录协同调节因子等实现分子功能，其作用信号通路与PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路及p53信号通路最为相关。其中，PI3K/Akt信号通路通过刺激促炎因子释放，诱发细胞凋亡失衡，使RA-FLS出现异常增殖[

21]，研究表明其对滑膜炎症以及骨破坏也有一定的影响[22]。p38 MAPKs信号通路与RA滑膜细胞密切相关，其抑制剂能够通过抑制 IL-1、IL-6及TNF-α等促炎因子的释放[23]。MiR-143-3p抑制剂能降低Ras、p-p38的表达，抑制Ras-p38 MAPKs通路的活化水平[24]。研究发现，Triad1可能通过p53信号通路诱发RA-FLS的凋亡[25]。

采用分子对接技术将威灵仙-牛膝药对活性成分槲皮素、山奈酚、黄芩素、汉黄芩素、β-谷甾醇与核心靶点蛋白CASP3、TP53、CCND1、HIF1A、VEGFA进行结合能力预测，结果显示槲皮素、山奈酚等成分与CASP3、CCND1等核心靶点蛋白有较强的结合能力，说明威灵仙-牛膝药对RA有一定的治疗作用。

因此，可以推断威灵仙-牛膝可以通过槲皮素、山奈酚、黄芩素、汉黄芩素等活性成分，调节CASP 3、TP 53、CCND 1、HIF1A、VEGFA、IL-6等靶点基因表达，影响PI3K-Akt、MAPK及p 53信号通路等的活化水平，抑制促炎因子的释放，改善滑膜炎症与骨破坏，从而发挥治疗RA的作用。

本研究以网络药理学和分子对接技术为基础，阐明了威灵仙-牛膝药对通过多成分、多靶点、多通路治疗RA的作用机制，为进一步临床实验及治疗提供新思路，但其结果的准确性还有待于体内、外试验的验证。

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