摘要
采用TCMSP、TCMID中药系统药理学平台筛选出三七的有效成分及靶点；在DisGeNET、OMIM数据库筛选出疾病靶点；运用Cytoscape 3.8.0绘制三七-活性成分-靶点网络图；通过STRING数据库绘制蛋白互作网络图；并运用DAVID平台进行GO功能富集分析以及KEGG信号通路分析；运用Auto Dock vina 4.2进行分子对接实验。
糖尿病足（Diabetic Foot，DF）是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）患者最常见的下肢微血管并发
中药三七具有止血散瘀、消肿定痛的功效，现代药理研究发现三七在抗肿
利用TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）、TCMID（https：//ngdc.cncb.ac.cn/）中药系统药理学平台检索“三七”，并根据ADME［即药物代谢动力学，指机体对外源化学物的吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）及排泄（excretion）过程］参数设口服利用度（Oral Bioavailability，OB）预测值>30%、类药性预测值（Drug-Likeness，DL）>0.18，之后运用UniProt蛋白数据库（https：//www.uniprot.org/）标化三七所有有效成分相对应的靶点，去重并删除无效靶点后获得药物作用靶点，之后在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中检索活性成分分子式，并运用Cytoscape 3.8.0（http：//www.cytoscape.org/）软件将药物-活性成分-靶点相关数据优化生成可视化的关系网络图。
在DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/home/）及OMIM（https：//omim.org/）中检索“diabetic foot”并对搜集到的靶点进行整合去重，获得DF疾病相关治疗靶点，之后利用Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）交集三七靶点与DF靶点获得共同靶点。
将共同靶点导入STRING数据库（https：//string-db.org/）并限定种属为人种，置信度为0.4，其他设置为默认，并转化靶点为蛋白质，获得共同靶点蛋白质互作网络关系图（Protein-Protein Interaction Networks，PPI），后下载tsv格式的上述网络数据导入Cytoscape计算Degree值来筛选排序核心基因并优化PPI网络。
将共同靶点导入DAVID平台（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp），设置P-value<0.05，并限定种属为Human，进行GO功能富集分析及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路分析，并评估分析结果。之后，利用R语言4.1.2（https：//www.r-project.org/）分类归纳生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）的GO功能分析柱状图，并重点分析BP；运用KEGG平台（https：//www.kegg.jp/）进行信号通路分析，并进行归类后将数据导入Cytoscape进行分析，生成靶点-信号通路网络图。后将共同靶点参与的主要信号通路进行评估并加以注释，生成三七治疗DF的主要信号通路图。
从Pubchem数据库下载筛选获得的三七活性成分mol 2格式的3D分子结构，运用PyMOL软件去除活性成分的水和残基，并设置为最低结合能的空间结构。在UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）中获取共同靶点基因对应的人体蛋白UniProt ID，并使用UniProt ID从PDB蛋白数据库（https：//www.rcsb.org/）中下载共同靶点3D结构，运用AutoDock 1.5.6去除蛋白水和残基以及无效金属离子并加氢，后根据配体活性口袋设置Grid Box，运用vina 4.2对接三七活性成分与共同靶点靶蛋白，并计算出最低结合能及结合方式后评估对接结果。将获得的核心化合物导入PyMOL及Discovery Studio 2019软件进行可视化并形成2D及3D对接图。
利用TCMSP中药系统药理学平台、TCMID平台检索“三七”，提重及删除无效靶点后获得119种活性成分。根据OB及DL预测值筛选获得7个最主要的三七主要活性成分及相对应的174个靶点。其中OB为生物口服利用度，表示经过首关效应后评价药物吸收利用度的指标；DL为类药性，表示其分子结构与现存药物的类似性。在运用UniProt蛋白数据库标化并注释上述所有靶点的UniProt ID后，在Pubchem数据库获得mol 2格式的上述7个活性成分的3D结构及分子式并注释。结果显示槲皮素（Quercetin）、豆甾醇（Stigmasterol）、邻苯二甲酸二异锌酯（Diop）、甘露醇（Mandenol）具有较高的口服利用度，而豆甾醇（Stigmasterol）、谷甾醇（Beta-sitosterol）、人参皂苷rh2（Ginsenoside rh2）具有较高的类药性。见
| 分子编码 | 活性成分名称 | OB（%） | DL | 分子式 |
|---|---|---|---|---|
| MOL000098 | Quercetin（槲皮素） | 46.43 | 0.27 | C15H10O7 |
| MOL000449 | Stigmasterol（豆甾醇） | 43.82 | 0.75 | C29H48O |
| MOL002879 | Diop（邻苯二甲酸二异锌酯） | 43.59 | 0.39 | C31H32O2P2 |
| MOL001494 | Mandenol（甘露醇） | 41.99 | 0.19 | C20H36O2 |
| MOL000358 | Beta-sitosterol（谷甾醇） | 36.91 | 0.75 | C29H50O |
| MOL005344 | Ginsenoside rh2（人参皂苷rh2） | 36.31 | 0.55 | C36H62O8 |
| MOL001792 | DFV（食脂素） | 32.76 | 0.18 | C15H12O4 |
在DisGeNET数据库及OMIM数据库中检索“diabetic foot”，并对搜集到的靶点进行整合剔重，获得DF疾病治疗靶点789个。之后利用Venny 2.1交集174个三七活性成分靶点与789个DF靶点，共获得20个共同靶点。见
图1 三七与糖尿病足的药物-疾病靶点Venny交集图
将三七-活性成分-靶点相关数据输入Cytoscape进行可视化处理后获得药物-活性成分-靶点拓扑网络图。三七的7个主要活性物质对应相关174个靶点，体现了中药成分对应多靶点的特点。三角形代表三七，菱形代表三七的活性成分，圆形代表活性成分相关靶点。可见Quercetin节点数最多，其次是Beta-sitosterol、Stigmasterol、Ginsenoside Rh2，由此可见其在三七中可能充当着较为重要的药理学角色。见
图2 三七-活性成分-靶点拓扑网络图
运用STRING数据库对交集获得的20个共同靶点进行PPI分析，可见不同基因之间的相互作用。基因之间功能关联表达分别用浅蓝色、绿色、红色、紫色、黑色、灰色实线标识为辅助数据库证据、基因相近、基因融合、实验证明、基因共表达、蛋白质同源等关系。另外两个节点之间线条越密集，表示基因之间关联性越强，在网络中起到的作用越高。把PPI数据以tsv格式下载后导入Cytoscape，运用Network analyzer插件计算Degree值，发现PPARG、TP53、AKT1的值最高，其次是MYC、ESR1、PTEN、IGF2、MMP1，后经重新可视化处理，节点大小及颜色的深浅根据Degree值大小进行排序，可见上述基因之间相互作用密切关联。见
图3 三七治疗糖尿病足的蛋白互作网络PPI图
利用DAVID平台进行GO功能富集分析发现，P-value<0.05的条目共有189个，归类分析上述条目发现分子功能（MF）主要有蛋白结合、酶结合、转录因子活性，特异性序列DNA结合、RNA聚合酶II核心启动子近端区序列特异性DNA结合，细胞组分（CC）主要位于核质、胞浆、细胞质等。对主要参与的生物过程（BP）进行重新归纳整理，发现主要集中于细胞增殖调控、炎症反应、氧化应激反应三类。其中BP归类于细胞增殖调控的有细胞增殖的正调控、细胞周期阻滞、对生长因子的反应、干细胞分化、细胞对神经生长因子刺激的反应、神经元死亡的正调控、表皮生长因子刺激的细胞反应、成纤维细胞增殖的正调控、脂肪细胞分化的正调控。BP归类于炎症反应过程的有细胞因子介导的信号通路、对脂多糖的反应、I-κB激酶/NF-κB信号的正调控、巨噬细胞分化、肿瘤坏死因子介导的信号通路调控。BP归类于氧化应激反应过程的有细胞对缺氧的反应、一氧化氮生物合成过程的正调控、细胞对外源刺激的反应、缺血反应、对氧化应激的反应、一氧化氮合酶活性的正调控、细胞对活性氧的反应等。运用R语言绘制GO柱状图，可见三七治疗DF主要可能是通过参与细胞增殖调控、炎症反应、氧化应激反应等生物过程而起到治疗作用。见
图4 三七治疗糖尿病足靶基因集的GO_BP分析图
运用KEGG平台进一步对共同靶点进行通路富集分析，共发现170个相关通路。结果显示三七治疗DF的作用机制可能与多种信号通路相关，如癌症相关通路、PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、甲状腺激素信号通路、IL-17信号通路、鞘脂类信号通路、松弛素信号通路、P53信号通路、C型凝集素受体信号通路、T细胞受体信号通路、Ras信号通路、JAK-STAT信号通路、FoxO信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路、mTOR信号通路等。对KEGG结果进一步筛选DF相关信号通路，最终保留了37个通路及对应的13个共同靶点。随后基于Cytoscape建立共同靶点-信号通路网络，发现共同靶点主要集中参与的通路为PI3K-AKT信号通路，其次是MAPK信号通路、IL-17信号通路，而三七治疗DF起主要作用的共同靶点是AKT1、CHUK、MYC。最后修饰上述信号通路数据获得最终的信号通路作用图，可见这些通路之间存在着复杂的相互作用关系，也间接验证了三七治疗DF是通过多种有效成分-多靶点-多通路模式产生的生物学作用。见
图5 三七治疗糖尿病足的靶点-信号通路网络图
图6 三七治疗糖尿病足的主要信号通路图
首先把三七活性成分视为配体，把共同靶点编码的蛋白视为受体，后从药物-活性成分-靶点拓扑网络中选出共同靶点相对应的配体进行AutoDock Vina对接，并计算每个复合体的结合能及结合方式，取最低结合能进行分析。通常，结合能<-8 kcal/mol表示受体与配体自由结合能力强；结合能<-5.5 kcal/mol表示自由结合能力较强；结合能<4.25 kcal/mol表示结合能力一般。结果显示，MMP1与Quercetin，AR与DFV，PPARG与Quercetin，CASP8与Beta-sitosterol，ESR1与Quercetin的结合能力强，其余对接的结合能力均显示较强。其中Quercetin与MMP1蛋白A链第180、181、182号位点的ASN、LEU、ALA以及第219号位点GLU以氢键对接，还与PPARG蛋白D链第259、271、285、342号位点的GLU、GLN、CYS、SER以氢键对接，此外还与ESR1蛋白A链第353、387、394、521号位点的GLU、LEU、ARG、GLY以氢键对接。DFV与AR蛋白A链第701、705、711、752号位点的LEU、ASN、GLN、ARG以氢键对接。研究表明三七活性成分与靶点可能通过上述结合模式进行结合，从而起到治疗DF的作用。见
| 受体＆配体 | 种属 | Pdb数据库蛋白编码 | 结合能（Kcal/mol） |
|---|---|---|---|
| MMP1＆Quercetin | Hsp | 966c | -10.0 |
| AR＆DFV | Hsp | 1e3g | -9.4 |
| PPARG＆Quercetin | Hsp | 1fm6 | -8.5 |
| CASP8＆Beta_sitosterol | Hsp | 1f9e | -8.4 |
| ESR1＆Quercetin | Hsp | 1a52 | -8.3 |
| AR＆Beta_sitosterol | Hsp | 1e3g | -7.9 |
| RUNX2＆Quercetin | Hsp | 6vg8 | -7.8 |
| AR＆Ginsenoside-Rh2 | Hsp | 1e3g | -7.6 |
| COL3A1&Quercetin | Hsp | 2v53 | -7.5 |
| PTEN＆Quercetin | Hsp | 7juk | -7.3 |
| SCN5A＆Quercetin | Hsp | 4djc | -7.1 |
| SCN5A＆Beta_sitosterol | Hsp | 4djc | -7.1 |
| MAOA＆Stigmasterol | Hsp | 2z5y | -6.9 |
| IFNG＆Quercetin | Hsp | 1eku | -6.9 |
| IFNG＆Ginsenoside-Rh | Hsp | 1eku | -6.9 |
| SCN5A＆Stigmasterol | Hsp | 4djc | -6.8 |
| AKT1＆Quercetin | Hsp | 2uzr | -6.6 |
| CHUK＆Quercetin | Hsp | 3brt | -6.4 |
| GJA1＆Quercetin | Hsp | 2ll2 | -6.2 |
| SCN5A＆Diop | Hsp | 4djc | -6.0 |
| MYC＆Quercetin | Hsp | 1a93 | -5.5 |
| ESR1＆Quercetin | Hsp | 1a52 | -8.3 |
图7 三七主要活性成分与靶点蛋白分子对接模式图
a.MMP1与Quercetin对接图；b.AR与DFV对接图；c.PPARG与Quercetin对接图；d.CASP8与Beta-sitosterol对接图；e.ESR1与Quercetin对接图；f.AR与Beta-sitosterol对接图
本研究应用网络药理学方法与分子对接技术，预测了三七治疗DF的可能分子机制。富集分析结果提示三七的潜在作用机制可能涉及细胞增殖调控、炎症反应、氧化应激反应等多种密切相关的生物学过程。研究显示，AKT1、CHUK、MYC可能是参与三七治疗DF的主要靶点，并通过PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路进行参与。另外分子对接结果显示配体与受体结合稳定，并提示槲皮素有可能是三七治疗DF的主要活性成分。
本研究筛选获得7个主要的三七活性成分，后绘制三七-活性成分-靶点拓扑网络发现槲皮素、谷甾醇、豆甾醇、人参皂苷rh2的节点数最多，故可认为其为三七治疗DF的主要活性成分。据研究发现，上述化合物具有广泛的药理学作用，如Jayachandran M
在筛选出的三七主要活性成分中，槲皮素节点数目显著多于其他活性成分，可能与槲皮素类现象有关。究其原因，首先考虑到本研究以单味药物为研究对象，其次相关研究表明槲皮素的确在治疗DF时存在药理学活性，且槲皮素广泛存在于各种植物。
通过交集三七活性成分靶点与DF疾病治疗靶点获得20个共同靶点，在此基础上通过筛选DF相关KEGG信号通路，最终获得37个通路和13个靶点，最后选取靶点-信号通路网络节点数排前三位的AKT1、CHUK、MYC。
AKT已被证明是参与调控细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移及葡萄糖代谢的ACG家族的丝氨酸/苏氨酸激酶。现认为AKT1是较为成熟的治疗DF的重要靶点，相关研究发现，AKT1可通过下游的mTOR/eNOS调节血管内皮细胞增
CHUK是一种保守的螺旋-环-螺旋激酶（Conserved helix-loop-helix ubiquitous kinase），也称激酶α亚单位抑制剂（IKKα/IKKA）或IKK1，是一种在NF-κB通路起到重要作用的丝氨酸/苏氨酸激
最后，MYC是最早发现于癌症的基因，包括C-myc、N-myc、L-myc、R-myc，具有促进细胞增殖、分化、转化的多种生物学作
本研究采用网络药理学方法，探讨三七的有效成分及其治疗DF的潜在机制。三七治疗DF的作用机制可能与细胞增殖调控、炎症反应、氧化应激反应三个主要的生物学过程密切相关。笔者就参与这些生物过程的PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、IL-17信号通路中确定了AKT1、CHUK、MYC三个重要的治疗靶点。此外进行分子对接结合能表示三七活性成分与靶点的结合稳定，为三七治疗DF的治疗靶点研究提供了新的线索。
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