摘要
将20只SD大鼠随机分为模型组及温针灸组各10只。两组大鼠均采用手术造模法制备膝骨关节炎模型，造模后模型组不予处理，温针灸组予膝前穴温针灸治疗。根据Lequesne MG评分标准，对大鼠分别于模型制备前、模型制备后2 w和治疗20 d后进行行为学检测，并通过micro-CT观察两组大鼠治疗20 d后软骨下骨的退变情况，采用ELISA法检测大鼠关节液中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的含量；采用Western blot法检测膝关节软骨组织IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的含量；采用RT-qPCR检测大鼠软骨组织中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的mRNA表达。
治疗20 d后，行为学检测发现，与模型组比较，温灸针组Lequesne MG评分明显降低（P<0.05）；micro-CT结果发现，温针灸组的BV/TV、Tb.Th、Tb.N上升，Tb.Sp降低，与模型组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）；ELISA、Western blot检测结果显示，与模型组比较，温针灸组的关节软骨下骨损伤程度明显较低，温针灸组关节液、软骨组织中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3含量均降低（P<0.05）。RT-qPCR结果显示与模型组比较，温针灸组IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的mRNA含量均降低（P<0.05）。
膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种以关节软骨退变、软骨下骨重塑、骨赘形成、滑膜炎症反应和血管生成为特征的慢性退行性疾
健康雌性清洁级SD大鼠20只，体质量（210±10）g，所有大鼠分笼饲养，由专人负责管理。实验室定期消毒，环境温度（23±2）℃，相对湿度50%～70%。所有大鼠适应性饲养1 w后开始实验。按照随机数字表法将大鼠分为模型组与温针灸组，每组10只。本研究符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。
艾粒（10 mm×15 mm，0.7±0.07 g/粒，南阳市卧龙汉医艾绒厂）；一次性无菌针灸针（0.30 mm×13 mm，苏州医疗用品厂有限公司）；IL-1β ELISA试剂盒（Mreda，批号：M149213-48T）；MMP-3 ELISA试剂盒（Mreda，批号：MF16171-48T）；ADAMTS-7 ELISA试剂盒（Zokeyo，批号：Y-97285-96T）；IL-1β抗体（Abcam，批号：ab254360）；ADAMTS-7抗体（Abcam，批号：ab201083）；MMP-3抗体（Abcam，批号：ab52915）；RIPA裂解液（Elabscience，批号：E-BC-R327）。
采用改良Hulth法建立KOA模
由同一位经过培训的医师，从疼痛程度、步态改变、关节活动范围、关节肿胀度四个方面，分别于模型制备前、模型制备后2 w、治疗20 d后对大鼠进行行为学评测，根据膝骨关节炎功能指数Leauesne MG量
干预20 d后，对两组大鼠做右侧膝关节micro-CT扫描。将大鼠麻醉固定于micro-CT床进行扫描，之后借助micro-CT系统配套的软件对扫描数据进行结构重建，利用三维旋转功能选取膝关节胫骨平台区域软骨下骨进行分析。骨组织分析指标：骨体积分数（bone volμme fraction，BV/TV）为皮质骨和松质骨骨量评价常用指标，能够反映不同样本骨小梁骨量的多少，该值增高说明骨合成代谢大于分解代谢，骨量增加；骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular nμmber，Tb.N）、骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp），上述三个指标是评价骨小梁空间形态结构的主要指标，在骨合成代谢大于骨分解代谢时，Tb.N和Tb.Th数值上升，Tb.Sp数值下降。
治疗20 d后，按照白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、聚蛋白多糖酶-7（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-7，ADAMTS-7）的ELISA试剂盒子上的操作方法使用ELISA检测大鼠关节液中的IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的含量。
检测两组大鼠右侧膝关节软骨组织IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3蛋白表达水平。摘取大鼠右侧膝关节，剥离软骨组织并粉碎后，再加0.5 mL RIPA裂解液没过软骨组织，于2 ℃下15000 r/min离心10 min，取上清液，对待测蛋白进行上样，依次完成电泳、转膜、封闭及免疫印迹显色等步骤。采用Image J软件分析条带灰度值。以目的蛋白条带与GAPDH灰度比值表示蛋白相对表达水平。
模型制备前两组大鼠Lequesne MG评分比较，差异无统计学意义（P>0.05）。模型制备后2 w，模型组、温针灸组Lequesne MG评分较之前升高（P<0.05），说明KOA大鼠造模成功。治疗20 d后，两组Lequesne MG评分明显降低（P<0.05），且与模型组比较，温针灸组的Lequesne MG评分更低（P<0.05）。见
| 组别 | 模型制备前 | 模型制备后2 w | 治疗20 d后 |
|---|---|---|---|
| 模型组 | 0.60±0.70 |
9.00± 0.9 |
6.50±1.5 |
| 温针灸组 | 0.60±0.70 |
8.90±1.2 |
8.20±1.1 |
注： 与制备前比较
治疗20 d后，观察两组大鼠胫骨平台软骨下骨情况，结果显示模型组大鼠软骨下骨损伤较温针灸组明显，见
图1 micro-CT扫描两组大鼠胫骨平台软骨下骨情况
A.模型组；B.温针灸组
| 指标 | 模型组 | 温针灸组 |
|---|---|---|
| BV/TV（%） | 33.07±2.06 |
49.36±1.2 |
| Tb.Th（μm） | 69.62±1.36 |
78.36±2.3 |
|
Tb.N（m | 5.02±0.33 |
6.53±0.1 |
| Tb.Sp（μm） | 118.25±1.66 |
102.89±1.6 |
注： 与模型组比较
治疗20 d后，与模型组比较，温针灸组关节液中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3含量均降低（P<0.05）。见
图2 ELISA检测两组大鼠膝关节液IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的表达情况
A.IL-1β的表达情况；B.ADAMTS-7 的表达情况；C.MMP-3的表达情况
治疗20 d后，与模型组比较，温针灸组大鼠软骨组织中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3含量均降低（P<0.05）。见
图3 Western blot检测两组大鼠膝关节软骨组织中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的表达情况
A.IL-1β的表达情况；B.ADAMTS-7的表达情况；C.MMP-3的表达情况；D.IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3蛋白表达的条带图
治疗20 d后，与模型组比较，温针灸组IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的mRNA含量均降低（P<0.05）。见
图4 RT qPCR检测两组大鼠膝关节软骨组织中IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3的mRNA表达情况
A.IL-1β mRNA的表达情况；B.ADAMTS-7 mRNA的表达情况；C.MMP-3 mRNA的表达情况
近年来，温针灸广泛应用于KOA的治疗，大部分研究认为其在镇痛、恢复关节功能等方面具有很好的疗
骨关节炎主要是以关节内异常的炎症反应及软骨等组织的破坏为主要病理表现。软骨细胞赖以生存的软骨细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成与降解失衡是导致软骨退变的重要原因之
MMPs家族构成了细胞外基质降解最重要的蛋白水解系统，其中MMP-3是基质溶解素中的重要成分，在KOA的不同病理时期均有表达，可促进软骨组织的退
KOA的病变不仅仅累及软骨，软骨下骨同样会发生改变。关节活动依赖于正常的解剖结构，早期KOA软骨下骨多以软骨下骨的吸收为主，表现为骨体积减小，可以出现应力性微骨
从本研究大鼠膝关节micro-CT的扫描结果可以看出，模型组大鼠软骨下骨损伤破坏较为明显，而温针灸组大鼠软骨下骨的形态较为规整，较模型组破坏程度明显降低。从骨组织分析发现，与模型组比较，温针灸组大鼠软骨下骨的骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量均有所上升，而骨小梁分离度有所下降，差异具有统计学意义（P<0.05），提示温针灸可以在一定程度上缓解大鼠膝关节软骨下骨的破坏。由此可见，温针灸不仅可以保护软骨，同时可以改善膝关节炎早期软骨下骨的损伤，延缓疾病的发生和发展。
综上所述，温针灸能够有效改善关节疼痛等症状，同时改善关节软骨下骨的破坏，降低关节软骨组织IL-1β、ADAMTS-7、MMP-3等细胞因子对软骨的降解作用，使KOA的症状得以改善。
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