摘要
基于GEO数据库及GEO2R平台筛选出冠心病的差异表达基因，利用药物靶点数据库分析平台，获取丹葛止痛方的活性成分及其对应的靶点，对比丹葛止痛方与冠心病的差异表达基因，获取共同靶点，基于共同靶点进行蛋白质相互作用（PPI）分析、GO功能与KEGG通路富集分析。
获取冠心病差异表达基因2517个，丹葛止痛方靶点222个，两者匹配后获得共同靶点30个，PPI网络中获取核心靶点前5的依次为VEGFA、ESR1、MMP9、MDM2、PTGS2；GO富集分析共筛选出45个条目，KEGG通路富集分析共筛选出43条信号通路。
冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称“冠心病”），是指由于冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄、痉挛或阻塞导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病，是临床最常见的心血管疾病之
利用GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）,以“Coronary heart disease”为检索词，获取到两个冠心病数据集GSE71226、GSE98583芯片，通过GEO2R与BioJupies在线分析工具分析两组芯片的差异表达基因，剔除差异倍数<1、P>0.05的数据，并绘制火山图与热图。
借助中药系统药理学分析TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以“鸡血藤、葛根、丹参、枳壳、百合、青皮、三七、当归、甘草”为关键词检索其活性成分和靶点，筛选出口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18的化学成分作为活性成分及相关靶标蛋白。用Uniprot（https://www.uniprot.org/）进行基因名转换。利用Cyto-scape 3.70软件中的cytoHubba插件根据度（Degree）值运算得到前5名活性成分。
将1.1中GSE71226、GSE98583芯片的差异表达基因与1.2中丹葛止痛方的靶点，利用Venny 2.10在线工具对比分析，获取共同靶点，将其输入STRING 11.5平台（http://cn.string-db.org/）获取构建蛋白质相互作用PPI网络数据，再运用Cytoscape 3.70软件构建丹葛止痛方PPI可视化网络图，并用Cytoscape hubba插件获取Degree值前5的靶蛋白。
为分析丹葛止痛方发挥药理作用的主要信号通路及生物过程，将共同靶点以Gene Symbol的格式导入DAVID 6.8生物信息平台（https://david.ncifcrf.gov/），设置物种为“HomoSapiens”，对共同靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）。以P≤0.05为筛选条件，选出GO功能条目与KEGG信号通路，绘制柱状图与气泡图及成分-靶点-通路图。
以GSE98583芯片中12例冠状动脉病变患者为实验组，6例正常人为对照组，获取差异表达基因520个，绘制前50位差异表达基因热图（见
图1 冠心病差异表达基因热图
X轴橙色为实验组，绿色为对照组，红色为基因高表达，蓝色为基因低表达；A为GSE98583芯片中的差异表达基因；B为GSE71226芯片中的差异表达基因
图2 冠心病差异表达基因火山图
蓝色为下调基因，红色为上调基因
通过TCMSP检索到丹葛止痛方含有919种活性成分，经筛选得到相关靶点的活性化合物207个，其中16种化合物同时存在于几种中药中，Degree值前5的成分依次为毛地黄黄酮、芒柄花素、柚皮素、β-谷甾醇、甘草查尔酮a，见表1。剔重后将191个化合物通过Uniprot数据库进行基因名转化后得到222个靶点。
表1 丹葛止痛方含有的Degree值前5位的活性成分
将2.1中得到的冠心病差异表达基因与2.2得到的靶点利用Venny 2.10在线工具对比分析，获取共同靶点30个（上调基因23个，下调基因7个）。将其导入String数据库，获取PPI相关数据并通过Cytoscape软件绘制PPI网络图。PPI网络中有30个节点，119条边，平均Degree值为10，通过Cytoscape_Hubba插件计算Degree值，其中排名前5的靶点依次为VEGFA、ESR1、MMP9、MDM2、PTGS2。见
图3 丹葛止痛方与冠心病共同靶点PPI网络图
Degree值越大，节点越大颜色越深；节点之间关联程度越高，线条越粗
共筛选出45个条目，其中生物过程23个、分子功能8个、细胞组分14个。生物过程主要富集在负调节cysteine-type肽链内切酶活动参与凋亡过程（negative regulation of cysteine -type endopetidase activity in apopotic）、正向调节细胞凋亡(positive regulation of apoptotic process)、参与cytokine-mediated 信号通路（cytokine-mediated signaling pathway）、蛋白质磷酸化（Protein phosphorylation）、应对缺氧（response to hypoxia）等过程 。分子功能主要富集在锌离子结合（enzyme binding）、序列特异性双链 DNA 结合（transcription factor activity, sequence-specific DNA binding）、调 节丝氨酸/苏氨酸蛋白质酪氨酸激酶活性等细胞功能（protine/serine/threonine/tyrosine kinase activity）等。细胞组分主要富集在核浆(nucleoplasm)、等离子体膜(plasmamembrane)、细胞膜表面(cell surface)等部分。见
图4 丹葛止痛方与冠心病共同靶点GO富集分析柱状图
X轴为条目富集个数，Y轴为BP、CC、MF富集条目
| 分子编码 | 成分名称 | 来源药物 | Degree值 |
|---|---|---|---|
| MOL000006 |
Luteolin （毛地黄黄酮） | 鸡血藤、枳壳、丹参 | 47 |
| MOL004328 |
Naringenin （柚皮素） | 枳壳、青皮、甘草 | 30 |
| MOL000358 |
beta-sitosterol （β-谷甾醇） | 鸡血藤、葛根、当归、三七 | 26 |
| MOL000392 |
Formononetin （芒柄花素） | 鸡血藤、当归、甘草 | 26 |
| MOL000497 |
licochalcone a （甘草查尔酮 a） | 鸡血藤、甘草 | 24 |
共筛选出43条信号通路，选取与冠心病相关的信号通路绘制气泡图（见
图5 丹葛止痛方与冠心病共同靶点KEGG信号通路气泡图
富集个数越多，气泡越大
图6 丹葛止痛方活血成分与冠心病共同靶点-通路网络图
紫色为PPI中排名前五的核心靶点
冠心病归属于中医学“胸痹”的范畴。张仲景在《金匮要略》中定义胸痹的病机为“阳微阴弦”，认为其病机特点为上焦阳气亏虚，痰饮、瘀血等阴寒之邪上犯，导致了胸痹的发
本研究发现丹葛止痛方富含多种活性成分，其中毛地黄黄酮、β-谷甾醇、芒柄花素、柚皮素、甘草查耳酮a存在于多种中药。毛地黄黄酮（Lut）是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎的特性。据报
通过PPI网络分析，获取治疗冠心病的核心靶点，排名前五的依次为VEGFA、ESR1、MMP9、MDM2、PTGS2。VEGFA可影响血管通透性，诱导巨噬细胞和小胶质细胞产生促炎和促血管生成介
GO 富集分析表明丹葛止痛方治疗冠心病的靶点在负调节 cysteine-type 肽链内切酶活动参与凋亡过程、正向调节细胞凋亡、cytokine- mediated 信号通路、蛋白质磷酸化、应对缺氧等过程；分子功能主要富集在锌离子结合、序列特异性双链DNA 结合、调 节丝氨酸/苏氨酸蛋白质酪氨酸激酶活性等细胞功能等；细胞组分主要富集在核浆、等离子体膜、突触后神经元等部分。
KEGG通路富集分析发现，核心靶点主要富集于PI3K-Akt信号通路、脂质和动脉粥样硬化、钙信号通道、流体剪切应力和动脉粥样硬化、TNF信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路等。PI3K-Akt信号通路可以调节缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达，参与血管生成的下游蛋白（如VEGFA）表达以改善缺
综上所述，丹葛止痛方主要是通过β-谷甾醇、柚皮素、毛地黄黄酮、芒柄花素等成分，作用于VEGFA、ESR1、MMP9、MDM2、PTGS2等靶点，对PI3K-Akt、钙通道、流体剪切应力和动脉粥样硬化、松弛素通路等信号通路进行调控，从而治疗冠心病。
参考文献
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