摘要
基于中医药数据库筛选活血疏肝汤有效成分及有效靶点，构建药物-成分-靶点网络。从数据库获得术后血栓及疼痛的疾病靶点集合，取疾病与药物靶点的交集获得共有靶点。进一步分析共有靶点之间的相互作用关系并获得关键靶点，在此基础上进行基因本体功能富集及京都基因与基因组百科全书通路富集分析。将高频靶点与活血疏肝汤的核心成分进行分子对接，了解药物与靶点的亲和力。
活血疏肝汤的药物-成分-靶点网络显示共有132个有效成分，693个有效靶点。取疾病靶点与药物靶点交集得到79个共有靶点，进一步通过蛋白相互作用分析获得关键靶点35个，以此预测活血疏肝汤干预术后血栓及疼痛的信号通路及涉及的主要生物学过程。分子对接显示活血疏肝汤的核心成分与术后血栓与疼痛的高频靶点有较好的结合作用。
20世纪90年代，Kehlet率先提出术后加速康复（Enhanced Recovery After Surgery，ERAS）的概
活血疏肝汤是国家级非物质文化遗产—平乐郭氏正骨法的经典名方，根据骨伤科疾病三期用药理论辨证论治组方而成，具有行气疏肝、活血止痛的作用。杜志
本研究利用网络药理学及分子对接技术，获取了活血疏肝汤的有效成分，并预测了这些成分的有效靶点，在分子水平上挖掘活血疏肝汤在TKA术后抗血栓及镇痛作用方面的潜在机制，为活血疏肝汤在TKA术后快速康复中的广泛应用与新药物的开发提供理论支持。
活血疏肝汤由当归、红花、桃仁、柴胡、大黄、黄芩、甘草以及枳壳共8味中药组成。在中医药系统药理学数据库（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）中检索各味中药所含的有效成分，根据口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和类药性指数（Drug Like Index，DL）≥0.18等参数对活血疏肝汤的有效成分进行筛选。
将筛选获得的有效成分转换为PubChem_CID，导入中医药分子机制生物信息分析数据库（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism for Traditional Chinese Medicine，BATMAN，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php），将参数设定为Score cutoff>20，P<0.05，获得活血疏肝汤的有效靶点。根据筛选获得的有效成分及靶点，构建药物-成分-靶点网络。
从毒性与基因比较数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD，http://ctdbase.org/）中获得有关术后血栓（Venous Thrombosis）及疼痛（Postoperative Pain）的所有靶点，根据相关分数（Inference Score）>50选取有效疾病靶点。从DisGeNET数据库（https://www.disgenet.org/ home/）中获得有关血栓（Thrombosis）及疼痛（Pain）的靶点，根据基因-疾病关联分数（Score-gda）>0.1选取有效疾病靶点。将两个数据库获得的疾病靶点合并，获得TKA术后血栓及疼痛相关的疾病有效靶点。取疾病靶点与药物靶点的交集，获得共有靶点。
将获得的共有靶点输入STRING 11.0 数据库（https://string-db.org/），种属参数设置为人（Homo sapiens），得出共有靶点的蛋白质间相互作用（Protein Protein Interaction, PPI），以Combined Score>0.4 为筛选标准，将筛选后的信息导入 Cytoscape 3.6.0 软件绘制PPI网络并进行网络拓扑分析，根据度值（Degree）>平均值筛选出关键共有靶点。
Metascape数据库（http://metascape.org/）可用于GO功能和KEGG信号通路富集分析，并且具有时效性和准确性的优点。将关键共有靶点上传至 Metascape，种属参数设置为人（Homo species），即可获得富集分析结果。
在蛋白数据库（The Protein Data Bank，PDB，http://www.rcsb.org/）中获得度值最高的前5个靶点的PBD结构文件。从TCMSP数据库中获得靶点最多的8个有效成分的Mol 2格式文件（3D结构）。将获得的文件导入在线分子对接网站SwissDock（http://www.swissdock.ch/ docking），依次分别进行高频靶点与核心成分的分子对接，分析活血疏肝汤中的有效成分与靶蛋白的亲和力。
将获得的有效成分导入BATMAN数据库，获得693个有效靶点。依据活血疏肝汤的有效成分及靶点，构建药物-成分-靶点网络。见
图1 活血疏肝汤的药物-成分-靶点网络
自CTD数据库中获得175个血栓靶点及38个疼痛靶点。自DisGeNET数据库获得36个血栓靶点及209个疼痛靶点。将靶点合并，获得TKA术后血栓及疼痛靶点共计389个。取药物靶点与疾病靶点的交集，获得79个活血疏肝汤与TKA术后血栓及疼痛的共有靶点。
通过STRING数据库对79个共有靶点进行PPI分析，将结果导入Cytoscape软件绘制PPI网络图，见
图2 靶点蛋白互作分析
GO功能富集分析结果主要分为生物过程（Biological Progress）、分子功能（Molecular Function）、细胞组成（Cellular Component）三个方面，主要涉及定位的维持（maintenance of location）、受体配体活性对细菌的反应（Receptor ligand activity response to bacterium）、细胞因子产生的调控（Regulation of cytokine production）、细胞对有机循环化合物的反应（Cellular response to organic cyclic compound）以及血液循环（Blood circulation）等，见
图3 GO功能富集分析
图4 KEGG通路富集分析
将PDB数据库中获得度值最高的前5个靶点（IL6、AKT1、TNF、PTGS2、IL1B）与TCMSP数据库中获得靶点最多的8个有效成分（beta-sitosterol、CLR、Supraene、beta-carotene、Phytoene、icos-5-enoic acid、gadelaidic acid、7,8-dimethyl-1H-pyrimido[5，6-g]quinoxaline-2,4-dione），依次分别通过SwissDock获取其结合能，见
图5 高频靶点与核心成分对接结合能（kJ/mol）
图6 PTGS2分别与Phytoene（图a）和beta-carotene（图b）的分子对接结果
网络药理学是研究药物作用机制的有效途径，通过网络公共数据库或早期研究获得的数据来解释功能药物的作用机制。网络药理学研究策略符合中医对疾病完整性的认
活血疏肝汤中含有的多种中药与抗血栓及镇痛作用密切相关。黄芩是一味被广泛应用的中药，具有抗炎镇痛等诸多生物学作用，对多种疼痛有治疗效
在PPI网络中，度值最高的前5个靶点被认为是活血疏肝汤治疗TKA术后血栓及疼痛的枢纽基因，可能在TKA术后加速康复中发挥重要作用。其中最值得注意的是，IL6是TKA术后炎症反应的重要指标及影响术后疼痛的重要炎症介
Go功能富集分析挖掘了活血疏肝汤在TKA术后抗血栓及镇痛等生物学过程中的作用机制，预测了活血疏肝汤作用于血栓形成及疼痛的靶点，提示其作用集中发生于细胞膜内外及细胞膜本身的脂阀，同时作用于内质网导致一系列的蛋白合成，并在此基础上通过受体与配体的相互作用，调控细胞因子的产生，影响血液循环，从而干预血栓与疼痛的病理学过程。KEGG通路富集分析则提示，活血疏肝汤主要通过调控肿瘤信号传导通路、神经活性受体-配体作用、肿瘤蛋白聚糖、缺氧诱导因子1信号传导通路来实现TKA术后抗血栓及镇痛的作用。
分子对接可以评估配体和蛋白质在热力学上是否具有结合的能力，还能进一步预测活血疏肝汤的作用靶点。若结合能<-5.0 kJ/mol，说明结合性好。结合能越小，结合的效果越好。活血疏肝汤的核心成分与TKA术后血栓及疼痛高频靶点的分子对接结果显示各成分与靶点的结合能均<-5.0 kJ/mol，说明所有核心成分与高频靶点均能获得良好结合。另外，PTGS2作为活血疏肝汤作用于TKA术后血栓及疼痛的典型受体，与Phytoene、Beta-carotene及Supraene等核心成分的结合能均小于-10 kJ/mol，且分子结构嵌合紧密，说明活血疏肝汤的核心成分与疾病高频靶点具有良好的结合活性，以此实现TKA术后抗血栓及镇痛作用。
本研究以网络药理学及分子对接技术为基础，系统分析了活血疏肝汤治疗TKA术后血栓及疼痛的可能机制。结果提示，活血疏肝汤中的主要有效成分在分子水平上通过多路径发挥药理作用，主要涉及肿瘤信号调控、抗缺氧、抗炎症等多种机制。本研究中，活血疏肝汤表现出良好的抗血栓及镇痛功能，提示活血疏肝汤具有成为治疗TKA术后血栓与疼痛候选药物的潜力，也为其药物作用机制的进一步研究提供了理论基础。
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