摘要
采用CCK-8法检测HK-2细胞活力。HK-2细胞分为正常对照组（NC组）、模型组（C组）和治疗组（T组）。C组加入含CsA 16.8 μmol/L的培养基干预24 h后换常规培养基继续培养24 h；T组加入含YSJZT 0.5 mg/mL的培养基干预48 h，造模同C组。干预完成后提取各组细胞总RNA，进行转录组测序检测差异表达基因（differentially expressed gene，DEG）。对交集的DEG进行GO功能显著性富集和KEGG通路显著性富集分析。
益肾降浊汤可回调环孢素A诱导的HK-2细胞活性下降；C组与NC组比较得到显著DEG 1410个；T组与C组比较得到显著DEG 127个；交集得到的66个DEG通过GO功能富集，主要集中在分子功能部分的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体绑定、雌激素酮磺基转移酶活性，生物学过程部分的雌激素代谢过程、表皮生长因子受体信号通路；KEGG通路富集主要在Fc epsilon RI信号通路、T细胞受体信号通路、甾类激素生物合成通路、ErbB信号通路；主要涉及集落刺激因子2（Csf 2）、磺基转移酶1E家族成员1（Sult1E1）、上皮调节蛋白（EREG）等基因。
关键词
• 作者单位 1.福建中医药大学附属人民医院肾病科（福建 福州 350000）；2.福建中医药大学附属第二人民医院肾病科(福建 福州 350000)；3.福建医科大学附属协和医院神经内科（福建 福州 350000）
环孢素 A（cyclosporine A，CsA）目前广泛用于治疗实体器官移植及自身免疫性疾病，显著延长了移植器官的存活时间和患者的生命，但CsA的急慢性肾毒性制约其临床应
中医认为，环孢素A肾损伤系药毒伤肾，导致脾肾亏虚为本，湿浊血瘀为
益肾降浊汤由太子参15 g、生黄芪30 g、生白术15 g、茯苓15 g、槲寄生15 g、怀牛膝15 g、桑椹15 g、丹参30 g、当归10 g、大黄9 g、六月雪15 g、车前子15 g、陈皮10 g组成，所有中药饮片购自福建中医药大学附属人民医院中药房。浓煎为1.0 g/mL。YSJZT用0.22 μm无菌滤器过滤,分装放置-80 ℃冰箱保存备用。
环孢素软胶囊(新山地明，批准文号J20140116，诺华制药)。Cell Count Kit-8 （CCK-8）试剂（Cat:M4839-500Tests，Abmole BioScience）。胎牛血清（gibco 10099-141C）；DME/F12 Medium（hyclone SH30023.01B）；青霉素-链霉素（双抗）（100X）（hyclone SV30010）；TRYPSIN 0.25%（1X）Solution（hyclone SH30042.01）；TRIzol(上海生工B511311)。荧光相差倒置显微镜（NIKON ® ECLIPSE Ts2R-FL）；二氧化碳培养箱(SANYO MCO-15AC)。
取对数生长期的HK-2细胞，按5×1
取对数生长期的HK-2细胞，按5×1
取对数生长期的HK-2细胞，按5×1
选择对数生长期的HK-2细胞按1
选择对数生长期的HK-2细胞按1
采用DESeq进行比对组间显著差异基因分析，筛选比对组间差异表达基因，显著差异表达基因筛选条件为：|log2（fold change）|≥1；且Qvalue<0.05。利用基因本体（Gene Ontology，GO）数 据 库 和 京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库，对交集的DEG进行GO功能与信号通路富集分析，以校正P<0.05为显著性阈值。
各浓度YSJZT 处理48 h后，0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL对HK-2细胞活力无明显抑制，各组细胞活力分别为（103.20±1.98）%、（99.15±2.19）%、（97.42±3.58）%；1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL对HK-2细胞活力有统计学意义的抑制作用，各组细胞活力分别为（91.07±4.59）%、（89.45±1.70）%、（92.49±1.99）%。结果见
图1 益肾降浊汤对CsA诱导HK-2细胞损伤细胞活力的影响
注： a.不同浓度益肾降浊汤对HK-2细胞活力的影响(n=5)；b.不同浓度CsA对HK-2细胞活力的影响(n=5)；c.不同浓度益肾降浊汤对CsA诱导HK-2细胞损伤细胞活力的影响(n=5)。独立实验重复3次。各组与NC组比较
经过各浓度CsA处理24 h后，撤掉CsA继续培养24 h，4.2 μmol/L、8.4 μmol/L对HK-2细胞活力无抑制，各组细胞活力分别为（96.96±4.52）%、（88.36±6.24）%；12.6 μmol/L、16.8 μmol/L、21 μmol/L、42 μmol/L对HK-2细胞活力均有统计学意义的抑制，各组细胞活力分别为（84.18±7.36）%、（81.34±9.47）%、（28.68±13.97）%、（0.33±0.21）%。结果见
与NC组比较，CsA 16.8 μmol/L模型组HK-2细胞活力显著降低，其细胞活力为（76.48±3.16）%；与模型组比较，YSJZT 0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL治疗后HK-2细胞活力明显提升，各组的细胞活力分别为（86.59±10.10）%、（87.64±5.91）%、（89.70±5.15）%。结果见
NC组细胞形态正常；C组为CsA诱导HK-2细胞损伤模型组，相差显微镜下HK-2细胞内发现大量大小不等的空泡及部分钙化点；T组为益肾降浊汤治疗组，HK-2细胞内空泡及钙化改善不明显。见
图2 相差显微镜下观察益肾降浊汤对环孢素A诱导HK-2细胞损伤形态的影响(200×)
RNA-seq测序结果发现，C组与NC组比对得到显著差异表达基因1410个（其中上调基因812个、下调基因598个），见
图3 模型组比对正常对照组差异表达基因柱状图及火山图
注： a.模型组比对正常对照组差异表达基因柱状图（X轴系C组比对NC组，Y轴系相应DEG数）；b.模型组比对正常对照组差异表达基因火山图（X轴系log2转换每组比对差异倍数值，Y轴系-log10转换筛选显著性值）
图4 益肾降浊汤治疗组比对模型组差异表达基因柱状图及火山图
注： a.治疗组比对模型组差异表达基因柱状图；b.治疗组比对模型组差异表达基因火山图
图5 不同比对组间交集基因韦恩图
注： a.治疗组比对模型组上调DEG交集模型组比对正常对照组下调DEG；b.治疗组比对模型组下调DEG交集模型组比对正常对照组上调DEG
交集得到的66个DEG进行GO功能富集分析,从细胞组分( cellular component)、生物过程( biological process)和分子功能( Molecular Function)三大功能类别中各选取富集最显著的10个GO term绘制柱状图。通过GO功能富集分析可看出益肾降浊汤治疗后显著回调的差异基因功能主要集中在生物学过程中的雌激素代谢过程( estrogen metabolic process)、表皮生长因子受体信号通路（epidermal growth factor receptor signaling pathway,EGFR）、视黄醇代谢过程（retinol metabolic process）；分子功能中的雌激素酮磺基转移酶活性（estrone sulfotransferase activity）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体绑定( granulocyte macrophage colony-stimulating factor receptor binding)；细胞组分中的主要变化在细胞外间隙( extracellular space)、质膜的组成部分（integral component of plasma membrane）。见图6。
结果发现，集落刺激因子2（Colony-Stimulating Factor 2,Csf 2）注释到分子功能的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体绑定中；磺基转移酶1E家族成员1（sulfotransferase family 1E member 1，Sult1E1）注释到分子功能的雌激素酮磺基转移酶活性及生物学过程的雌激素代谢过程中；上皮调节蛋白（epiregulin，EREG）注释到生物学过程的EGFR信号通路中。
差异表达基因KEGG通路富集分析以P<0.05为显著性阈值，对交集基因进行KEGG富集分析，以最显著变化的11个通路绘制气泡图，其中涉及的信号通路包括：甾类激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）、细胞色素P450代谢的生物异源物质（Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、药物代谢-细胞色素P450（Drug metabolism-cytochrome P450）、视黄醇的代谢（Retinol metabolism）、ErbB信号通路（ErbB signaling pathway）、FcεRI 信号通路（Fc epsilon RI signaling pathway）T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）等。见
图7 交集差异表达基因KEGG通路富集分析气泡图
图6 交集差异表达基因的GO富集分析三大功能类别柱状图
结果发现，Csf 2注释到Fc epsilon RI信号通路、T细胞受体信号通路；Sult1E1注释到甾类激素生物合成通路；EREG注释到ErbB信号通路。
环孢素A肾损伤属于中医学“关格”“腰痛”等范
故课题检测益肾降浊汤对环孢素A诱导HK-2细胞损伤细胞活力的影响。如
RNA-seq测序结果发现模型组与NC组比对得到显著差异表达基因1410个（其中上调基因812个、下调基因598个）；YSJZT治疗组与模型组比对得到显著差异表达基因127个（其中上调基因71个、下调基因56个）。为明确YSJZT减轻CsA肾毒性的主要靶基因，将T组比对C组上调DEG交集C组比对NC组下调DEG，得到36个DEG；将T组比对C组下调DEG交集C组比对NC组上调DEG，得到30个DEG。对交集的66个基因进行GO 富集分析,可看出YSJZT治疗后显著回调的差异基因功能主要集中在生物学过程中的雌激素代谢过程、表皮生长因子受体信号通路、视黄醇代谢过程，分子功能中的雌激素酮磺基转移酶活性、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体绑定。KEGG通路富集分析发现，涉及信号通路有甾类激素生物合成、ErbB信号通路、FcεRIFc 信号通路、T细胞受体信号通路等。提示益肾降浊汤减轻环孢素A肾小管细胞毒性的作用机制比较广泛。
Csf 2在GO功能分类分子功能中的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体绑定和KEGG pathway富集的Fc epsilon RI信号通路、T细胞受体信号通路中发挥作用。肾损伤后巨噬细胞在肾内积聚，并经历由促炎(M1)表型向正常修复所需的选择性激活(M2)表型的转变。在人M1巨噬细胞与HK-2细胞共培养的培养基中Csf 2增加最多，Csf 2只由HK-2细胞分泌。重组人Csf 2蛋白促进巨噬细胞由M1向M2表型转化。暴露于外源性Csf 2后，M1巨噬细胞诱导的HK-2细胞凋亡和活性氧释放减弱。在盲肠结扎穿孔脓毒症小鼠腹腔注射Csf 2中和抗体会加重肾损伤，抑制肾小管增殖，进而降低存活率。而重组小鼠Csf 2蛋白可以挽救脓毒症小
Sult1E1在GO分类分子功能中的雌激素酮磺基转移酶活性、生物学过程中的雌激素代谢过程和KEGG pathway富集的甾类激素生物合成通路中发挥作用。研究表明雌激素可以减轻小鼠急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI),雌激素Sult1E1通过磺化和失活雌激素在雌激素稳态中发挥重要作用，在小鼠急性肾缺血再灌注损伤模型，Sult1E1基因敲除或对其药理抑制减轻了雌雄小鼠AKI，与性激素的存在无关。Sult1E1在AKI的发病机制中具有新的功
EREG在GO分类生物学过程中的EGFR信号通路和KEGG pathway富集的ErbB信号通路中发挥作用。Epiregulin与表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）在促进肾近端小管上皮细胞（renal proximal tubular cells，RPTC）增殖和迁移方面具有相当的作用。表皮调节蛋白是RPTC的一种有效的有丝分裂原，可能通过激活EGFR和PI3K/Akt通路促进肾脏再
综上，益肾降浊汤通过多靶点恢复环孢素A诱导HK-2细胞损伤的细胞活力，其中调控Csf 2、Sult1E1、EREG多个靶基因及其相关信号通路，可能是益肾降浊汤减轻环孢素A肾毒性的作用机制。以上分析的可能靶基因仍需要体内外实验进一步验证。
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