摘要
通过胫骨内注射乳腺癌细胞建立乳腺癌骨转移动物模型，给予扶正固本方药干预，给药后采用IVIS检测乳腺癌在骨环境中的生长情况，X-ray和TRAP染色分析骨破坏及破骨细胞活性情况，并采用ELISA检测小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、PTHrP、RANKL、OPG、TGF-β、IGF、PDGF细胞因子的表达改变。
IVIS结果显示扶正固本方药可减缓乳腺癌在骨环境中的生长，X-ray和TRAP染色表明扶正固本方药可以减少乳腺癌骨转移引起的骨破坏及破骨细胞活性， ELISA结果显示扶正固本方药可以降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、PTHrP、RANKL、TGF-β、IGF、PDGF的表达水平，提高血清中OPG的表达水平。
• 作者单位 福建中医药大学附属厦门中医院（福建 厦门 361009）
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率约占所有肿瘤的10.4%，且发病率呈逐年上升趋
在乳腺癌患者长期的综合治疗中，中医药的作用已经得到广泛肯
因此，依据扶正固本的根本治则，本实验选取具健脾补肾功效的中药，拟定基本方（由黄芪、党参、茯苓、淫羊藿、补骨脂等药物组成），通过动物实验探讨扶正固本方药减轻骨破坏的作用及其可能的分子机制，为中医药防治乳腺癌骨转移、骨破坏提供实验依据。
TRAP染色试剂盒（购自Sigma公司），细胞培养基DMEM、胰酶、胎牛血清、双抗（购自Gibco公司），TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、RANKL、OPG、TGF-β、IGF ELISA试剂盒（购自ThermoFisher公司），PTHrP ELISA试剂盒（购自默沙克公司），PDGF ELISA试剂盒（购自R&D SYSTEMS公司），唑来膦酸注射液（购自江苏正大天晴药业股份有限公司）。扶正固本方（黄芪30g、党参15g、茯苓9g、淫羊藿30g、补骨脂30g）由厦门市中医院中药房提供。
人乳腺癌细胞MDA-MB-231-luc 以10%胎牛血清的细胞培养液DMEM，置于5% CO2、37℃培养箱培养，每2～3天换液一次，待细胞生长至80%～90%，采用0.25%胰酶消化，传代培养。造模当天，采用0.25%胰酶消化培养皿中的MDA-MB-231-luc细胞，收集细胞悬液，经800 rpm离心5 min后，将沉淀细胞用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2遍，血细胞计数器计数，采用PBS重悬，使细胞终浓度为5×1
选取6～8周龄雌性裸鼠40只，每笼5只，饲养于SPF级动物中心，每三天清理鼠笼一次，直至实验结束。购买到的裸鼠在动物中心适应性饲养3天，确认其无烈性传染病，并基本适应新的饲养环境后，开始下一步实验。根据体重排序，采用随机数字表法将裸鼠分为4组，分别为空白对照组、模型组、唑来膦酸组和扶正固本组，每组10只。
所有裸鼠均被置于超净工作台中，采用2.5%的阿弗丁（0.3～0.4）ml/20g麻醉。待裸鼠麻醉后，沿髌骨前方作约1cm～2cm纵形皮肤切口，沿髌韧带边缘作1cm切口，暴露胫骨上缘。模型组、唑来膦酸组和扶正固本组这三组裸鼠均采用显微注射器（规格：26G）向胫骨内注射4×1
扶正固本组每天灌胃以体表面积换算所得剂量组药汤剂，为14.82g/kg体重[计算方法：小鼠的给药量（g/kg）=成人剂量（g/kg）×（人的转换因子/小鼠的转换因子）]；唑来膦酸组皮下注射唑来膦酸，0.2mg/kg体重；空白对照组和模型组每天只灌胃相应剂量的生理盐水。各组均每周给药3次，连续给药28天。观察裸鼠外观及行为，拍照并记录其体重变化。
根据裸鼠的体重，侧腹腔注射相应剂量的Luciferase-D荧光底物，5min后将裸鼠置于麻醉箱气体麻醉。将麻醉好的裸鼠置于IVIS®-200动物活体荧光成像系统中荧光成像，观察肿瘤的大小。
为观察乳腺癌引起的骨质破坏程度，采用阿弗丁麻醉裸鼠后，将裸鼠置于柯达X线成像系统中，拍照观察乳腺癌骨转移或骨内注射后引起的骨质破坏面积百分比（骨质破坏面积百分比=骨破坏面积÷胫骨骨质总面积×100%）。
于末次给药后2 h，用剪镊快速摘除眼球取血，收集各组裸鼠的血液放入促凝管中，4℃下静置1 h，室温3000 rpm离心5 min，分离血清，采用ELISA阵列试剂盒检测裸鼠血液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17、PTHrP、RANKL、OPG、TGF-β、IGF、PDGF细胞因子的表达水平，以空白对照组为基础值计算给药后裸鼠血液中以上细胞因子的表达改变。具体操作根据ELISA试剂盒说明书进行。
麻醉处死裸鼠，取出胫骨经4%多聚甲醛固定24h后，经0.5M的EDTA脱钙10天，再经梯度乙醇、二甲苯、石蜡浸泡（即脱水至蜡处理），石蜡包埋，切成4μm厚度切片，挑选包含骨髓腔的胫骨切片，按常规脱蜡至水后，采用TRAP染色试剂盒进行组织染色。
根据各组裸鼠胫骨内乳腺癌细胞的荧光值情况（见
图1 各组裸鼠IVIS检测结果
注： A为各组小鼠胫骨内IVIS荧光图像，B为各组小鼠胫骨内乳腺癌IVIS荧光值的柱状图，由图可见唑来膦酸组和扶正固本组的IVIS值均小于模型组，差异具有统计学意义（与模型组比较
根据各组裸鼠胫骨X-ray检测结果（见
图2 各组裸鼠胫骨内X-ray检测及骨破坏面积
注： A为各组小鼠胫骨X-ray图片，B为各组小鼠胫骨骨破坏面积与胫骨总面积的比值统计图，由图可见胫骨内注射乳腺癌细胞可引起明显的溶骨性破坏，唑来膦酸和扶正固本方药干预后，骨破坏的面积减小，与模型组比较具有统计学意义（与模型组比较
根据各组裸鼠胫骨切片的TRAP染色检测结果（见
图3 裸鼠胫骨TRAP染色及TRAP(+)细胞数目
注： A为各组小鼠胫骨切片的TRAP染色图片，B为各组小鼠胫骨TRAP阳性细胞数目的统计图，由图可见胫骨内注射乳腺癌细胞可引起明显的破骨细胞活化（TRAP阳性细胞数量明显增多），唑来膦酸和扶正固本方药干预后，TRAP阳性细胞数量有所减少，与模型组比较，差异具有统计学意义（与模型组比较
注： 与模型组比较
注： 与模型组比较
注： 与模型组比较
乳腺癌骨转移属中医学“骨蚀”“骨瘤”“骨痹”“骨疽”等范畴。骨转移癌可表现出局部肿块坚硬不移、疼痛、入夜尤甚、皮色不变、面色晦暗等临床特征；其发生、发展与中医的肾和脾关系密
正常的骨代谢是通过成骨细胞的成骨作用与破骨细胞的骨吸收作用进行调节，从而保持一种动态平
首先，乳腺癌细胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等炎症因子，一方面刺激成骨细胞分泌RANKL，另一方面刺激单核细胞融合成破骨细胞。其中 IL-6 在诱导肿瘤细胞增殖、抑制凋亡和刺激破骨细胞生成、抑制成骨细胞分化中具有重要作
其次，乳腺癌细胞产生的 PTHrP 是主要的破骨细胞激活因
再者，TGF-β、IGF、PDGF等细胞生长因子是调控乳腺癌骨转移发生、发展的重要因
综上所述，扶正固本方药可通过降低炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17）、细胞生长因子（TGF-β、IGF、PDGF）以及促破骨细胞因子（PTHrP、RANKL）的表达，增加OPG的表达，从而减缓乳腺癌骨细胞在骨环境中的生长，以及减轻乳腺癌细胞所引起的骨破坏。
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