摘要
采用钳夹法建立小鼠急性脊髓损伤模型，于造模后第3天将Mash-1修饰的胚胎干细胞移植到脊髓损伤部位，并给予益气化瘀方干预。通过观察小鼠的后肢功能评分、脊髓的剩余面积以及神经营养因子、炎症因子和凋亡相关基因的表达改变；并采用免疫荧光检测OCT3/4、nestin、β-tubulin Ⅲ、GFAP的阳性细胞数目，分析移植细胞在体内的存活和分化情况。
与模型组比较，益气化瘀方可减少炎症因子TNF-α和凋亡基因caspase-3的表达，轻微提高小鼠运动功能。与单纯干细胞移植组比较，益气化瘀方联合Mash-1修饰胚胎干细胞移植能减少炎症因子TNF-α的基因表达水平，提高移植细胞的存活数量，进而改善小鼠的后肢运动评分。
• 作者单位 1.福建中医药大学附属厦门中医院（福建 厦门 361009）；2.上海中医药大学脊柱病研究所/上海中医药大学附属龙华医院（上海 200032）
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种严重的中枢神经系统损伤，全球范围每年平均每百万人口中约有10.4~83人发生SC
在既往的研究中，本课题组观察到益气化瘀方可减轻慢性脊髓损伤的炎症反
KM种小鼠60只，雄性，无特殊病原体（specific pathogen free，SPF）级，6~8周龄，体重（20±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。
DMEM、L-gul、β-mercaptoethanol、胰酶（GIBCO公司，美国）；FBS（BIOCHROM公司，英国）；LIF 细胞因子（CHEMICON公司，美国）；nestin抗体、β-tubulin III抗体（Abcam公司，英国）；荧光二抗（KPL公司，美国）；逆转录试剂盒、荧光素酶（TAKARA公司，日本）。益气化瘀汤剂由上海中医药大学附属龙华医院提供（组成：黄芪15g，党参12g，丹参9g，川芎9g，人工麝香0.03g。煎煮浓度为1g生药/mL）。
按前期的实验方法培养Mash-1基因修饰的小鼠胚胎干细胞（CE3-Mash-1细胞
小鼠购买后适应性喂养3天。按体重随机分为假手术组、模型组、益气化瘀方组（以下简称中药组）、Mash-1修饰胚胎干细胞移植组（以下简称干细胞组）、益气化瘀方联合Mash-1修饰胚胎干细胞移植组（以下简称联合组）。假手术组只暴露脊髓不予Dumont 5号镊夹持损伤脊髓。其余各组按Plemel JR报
术后第3天，根据小鼠体重，采用氯胺酮麻醉小鼠，固定于俯卧位，碘伏常规消毒，拆除背部的缝线，直接暴露损伤的脊髓节段。暴露完成后，干细胞组及联合组用10μL的微量进样器抽取之前准备好的细胞悬液，移植的细胞数目为1×1
待小鼠苏醒后，中药组、联合组给予益气化瘀汤剂（0.1mL/10g体重）灌胃；假手术组、模型组、干细胞组给予等体积生理盐水灌胃。每天灌胃1次，连续给药4周。各组小鼠分别于建模后的1、7、14、21、28天进行BMS评分。
分别于脊髓损伤建模后的14和28天，采用10%水合氯醛麻醉，每组处死6只小鼠。其中，3只小鼠的脊髓标本放置于4%多聚甲醛中固定，另3只小鼠脊髓标本放置于液氮中保存，择期抽提总RNA。小鼠脊髓标本经4%多聚甲醛固定16h后倒去固定液，清水冲洗2h后，将标本放置于15%和25%蔗糖溶液中各脱水24h，最后去除蔗糖溶液，经OCT胶包埋，冰冻切片机将小鼠脊髓切成5μm厚度组织切片，用防脱载玻片粘取组织。切片完成后放置于室温通风1天，晾干切片，装入切片盒中，放置-20℃冰箱保存。
从-20℃冰箱取出切片，室温放置10min；将切片放置于清水中5min；苏木素 2min；清水冲洗；0.04%的盐酸酒精分化5s；清水冲洗；2%氨水返蓝10min；清水冲洗；伊红2min；清水冲洗；85%、95%、100%梯度乙醇各2min；二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III各2min；中性树胶封片；60℃烤箱烘烤过夜；Olympus相差显微镜采片。
从-20℃冰箱中取出切片，放置于PBS中浸泡5min，取出切片放置于湿盒中，用纸巾擦除组织周围的水分，蛋白酶K消化10min（修复抗原），PBS洗2min×3次，0.5%PBST通透20min，PBS洗2min×3次，加入5%BSA封闭20min，加一抗OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP（1：500稀释），4℃过夜。37℃恒温箱孵育1h，PBS洗5min×3次，红色荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1h，PBS洗5min×3次，加入1μg/mL的DAPI室温避光孵育10min，PBS洗2min×3次，荧光显微镜下采片。阴性对照用PBS代替一抗。
从液氮中取出脊髓组织，用分析天平秤取100mg脊髓组织，用去酶的眼科剪将脊髓组织剪碎，加入1mL TRIZOL，常规抽提总RNA，经紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度后，采用TAKARA逆转录试剂盒按试剂盒实验步骤将RNA转录成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR检测BDNF、CNTF、NGF、NT3、IL-1、IL-6、TNF-α、MIP2、caspase-3、bax、bcl-2及β-actin的基因表达情况。
根据GenBank检索目的基因序列设计引物，采用primer 5软件设计扩增引物序列，由华大基因公司合成引物序列。各基因名称和序列见
术后第1天，假手术组的小鼠后肢的运动功能均为正常，评分值为9分；造模后各造模组的小鼠后肢出现明显运动功能障碍，评分均为0。术后第7天，即细胞注射和给药后第4天，干细胞组和联合组的小鼠后肢运动功能有部分恢复，与模型组和中药组比较均具有统计学差异（P＜0.05）。在造模后的第14、21和28天，干细胞组和联合组的小鼠后肢运动功能进一步恢复，与模型组和中药组比较均具有统计学差异（P＜0.01）。在造模后第21和28天时，联合组小鼠后肢运动功能明显优于单纯细胞移植的干细胞组，比较具有统计学差异（P＜0.05或P＜0.01）。中药组小鼠的后肢运动功能评分略高于模型组，但无明显的统计学差异（P＞0.05）。见
图1 术后第28天各组小鼠的后肢运动功能照片
注： 由图可见，假手术组小鼠后肢着地有力，足趾分开，尾巴抬起；模型组小鼠后肢不能弯曲；中药组小鼠的后肢可轻微弯曲；干细胞组和联合组小鼠后肢功能明显改善，可弯曲后肢使足掌着地
注： 与模型组比较
从脊髓横切面HE染色可见，在造模后的14天和28天时，模型组和中药组小鼠的脊髓横切面剩余面积明显减少，与假手术组比较存在统计学差异（P＜0.01）。干细胞组和联合组的小鼠脊髓剩余面积均有明显的恢复，与模型组和中药组比较具有统计学差异（P＜0.01）。假手术组、干细胞组和联合组三组间的脊髓剩余面积无明显差异（P＞0.05）。见
图2 造模后14d和28d时各组脊髓横切面HE染色图
注： 假手术组脊髓横切面结构完整，白质与灰质界限清楚；各造模组的脊髓横切面结构破坏，灰白质边界不清楚，空洞形成，脊髓剩余面积减少。其中，模型组的剩余面积减少最严重，干细胞组和联合组的脊髓剩余面积得到明显恢复（40×）
注： 与模型组比较
由于CE3胚胎干细胞带有GFP，因此可在荧光显微镜下通过绿色荧光跟踪移植细胞在体内的存活数量和所在位置，进一步通过带红色荧光的二抗与不同的一抗结合可观察到移植的细胞在体内的存活和分化情况。免疫荧光染色结果显示，干细胞组与联合组的OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP四种细胞标记蛋白的阳性细胞比例无明显差别，见
图3 术后第14d和28d，脊髓组织免疫荧光染色图
注： A为OCT3/4，B为nestin，C为β-tubulin III，D为GFAP；GFP为移植细胞发出的绿色荧光，DAPI为所有细胞核的染色，三者重叠则为移植细胞在体内表达OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP的阳性细胞，分别标示为未分化的CE3细胞、神经干细胞、神经元细胞和胶质细胞，如▶所示（×400）
注： 两各细胞移植组的OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP四种细胞标记蛋白的阳性细胞比例无明显差别（P＞0.05）
图4 造模28d后干细胞组和联合组的移植细胞在脊髓损伤部位的存活情况图
注： 联合组GFP阳性的细胞数量明显多于干细胞组（×200）
注： 与干细胞组比较
本实验主要检测各组小鼠损伤脊髓的神经营养因子(BDNF、CNTF、NGF、NT-3)、炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2)和凋亡相关基因(caspase-3、bax、bcl-2)的表达情况。在造模14天时，模型组的炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相关基因caspase-3的表达明显增高；中药组的炎症因子IL-1、TNF-α和凋亡相关基因caspase-3的表达相对模型组减少，同时神经营养因子BDNF的表达略微升高；干细胞组和联合组小鼠的炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相关基因caspase-3的表达明显降低，同时神经营养因子的BDNF、CNTF、NGF、NT-3表达均有升高。此时，干细胞组和联合组在以上几种基因的表达无明显差别（见
图5 造模后14 d和28d各组神经营养因子、炎症因子和凋亡相关基因的表达情况图
益气化瘀方能轻微改善小鼠脊髓损伤后的神经功能，可能通过减少炎症因子IL-1、TNF-α和凋亡相关基因caspase-3的表达，促进神经营养因子BDNF、NT-3的表达，进而减轻脊髓的继发性损伤。文献报道，益气化瘀方可以减轻慢性脊髓损伤和椎间盘退变引起的炎症反
益气化瘀方由黄芪、党参、川芎、丹参、人工麝香组成。方中重用黄芪，其味甘，性微温，入脾、肺，具有补中益气、利水消肿之功，可大补脾胃之元气，使气旺血行、瘀去络通而为君。党参补中益气，健脾益肺为臣，与黄芪合用以增强健脾益气之功。川芎辛、温，行气开郁、活血止痛，善行血中之气；丹参活血化瘀、行气止痛，配合川芎则有行气活血、祛瘀生新之效，共为佐药。使以麝香辛香走窜,活血通络、散瘀止痛，以助黄芪、丹参行气化瘀之功。全方共奏益气化瘀通络之效。
脊髓损伤后炎症因子的表达明显上升，实验研究表明通过减轻脊髓损伤后的炎症反应具有一定的治疗作用。中药黄芪、丹参和川芎均具有提高SOD活性，减少继发性损伤，促进神经功能恢
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