摘要
选取SD大鼠72只，随机分为空白组、模型组、麻仁丸组以及肠润方高、中、低剂量组。利用复方地芬诺脂制备功能性便秘大鼠模型，造模成功后，分别使用肠润方低、中、高剂量水煎剂（5.5、11、22g/kg/d）及麻仁丸-生理盐水混悬液（0.3g/kg/d）灌胃进行干预。通过免疫组化法、Western-Blot及RT-PCR法检测大鼠结肠组织中c-kit、SCF的分布及蛋白与基因表达水平。
与空白组相比，模型组大鼠结肠组织c-kit、SCF蛋白及mRNA表达水平均显著降低（P<0.01）；同模型组相比，肠润方高、中剂量组结肠组织c-kit、SCF蛋白及mRNA表达水平显著升高（P<0.01），免疫组化结果显示c-kit、SCF的表达与肠润方剂量呈正相关。
• 作者单位 1.福建中医药大学附属厦门中医院/厦门市盆底动力学重点实验室（福建 厦门 361009）；2.北京中医药大学（北京 100029）；3.厦门大学医学院（福建 厦门 361000）
功能性便秘（function constipation，FC）是消化系统常见病、难治病，全球发病率逐渐上升。FC的发生与多种因素相关，但发病机制尚未完全阐明。研究显示，伴有结肠动力障碍的FC患者占相当比
健康SD大鼠72只，雌雄各半，体重（220±20）g，由厦门大学实验动物中心采购提供，许可证号：SYXK(闽)2013-0006。饲料、垫料来源同上，饲养室温度20℃～25℃，湿度45%～55%。
肠润方（炒白术20g，玄参15g，麦冬15g，火麻仁15g，枳实15g，槟榔15g），肠润方水煎剂：将95g 生药饮片浸泡于蒸馏水中（蒸馏水略没过饮片即可）1h后回流煮沸30min，滤出药液，再加入蒸馏水（蒸馏水略没过饮片即可），同法煮沸30min，过滤。将两次得到的滤液混合，在3500rpm离心滤液10min,药液旋蒸浓缩至47.5mL，得到200%肠润方水煎液。实验前配制含生药量分别为 0.5g/ml、1g/ml和2g/ml的肠润方水煎液。
麻仁丸：福州海王金象中药制药有限公司（批号：1805042）；复方地芬诺酯：新乡市常乐制药有限公司（批号：17040952）；PBS磷酸缓冲液（索莱宝公司，批号：P1010）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司，批号：P0010S）；PVDF膜（迈博瑞公司，批号：R7EA3809G）；c-kit抗体（Thermo Fisher公司，批号：34-8800）；SCF抗体（Abcama公司，批号：ab64677）；IgG抗体（Abcama公司，批号：ab150077），RNA提取试剂盒（Promega公司，批号：LS1040）；逆转录试剂盒（Promega公司，批号：A5001）；RT-PCR试剂（全式金公司，批号：AQ101-03）；免疫组化染色试剂盒（索莱宝公司，批号：SP0041）。
72只健康SD大鼠正常喂养和观察1周，随机分为空白组、模型组、麻仁丸组以及肠润方高、中、低剂量组，共6组，每组12只。根据课题组前期实验造模方法造
造模成功后，空白组、模型组均予蒸馏水1ml/100g/天，2次/天灌胃；麻仁丸组予规格为0.6g/粒的麻仁丸按成人（60kg）日服计量2.4g换算成SD大鼠剂量0.3g/kg/d，2次/d灌胃；肠润方高、中、低剂量组根据《中药药理实验方法学》计算出中药人鼠等效剂量，按成人（60kg）日服剂量95g换算成SD大鼠服用剂量为低剂量组5.5g/kg/d，中剂量组11g/kg/d，高剂量组22g/kg/d，2次/d灌胃，各组连续灌胃14天后进行取材。
末次给药结束后，禁食不禁水12h，颈椎脱臼处死动物，打开大鼠腹腔取2cm结肠肠管共2份，1份经生理盐水清洗后用OTC保鲜剂固定，液氮保存待western blot及RT-PCR测定，1份固定于中性福尔马林中，以待免疫组化测定。
取放于4%多聚甲醛固定的组织，经脱水、包埋制成连续切片。石蜡切片脱蜡后进行抗原修复。用组化笔画圈围住组织，滴加3%过氧化氢灭活内源酶活性。加山羊血清封闭液封闭非特异性位点，室温10min。甩掉封闭液，圈内滴加一抗（1:1000稀释的兔抗鼠c-kit或1:1000稀释的兔抗鼠SCF）盖住组织，放入湿盒内4℃过夜。二抗（1:3000稀释的羊抗兔IgG）室温孵育10min。链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液在室温下孵育10min，DAB显色。苏木素复染细胞核，自来水冲洗反蓝，1%盐酸酒精分化3秒，自来水冲洗三分钟，脱水，中性树胶封片。用Definiens Tissue StudioTM图象分析系统,测定各组c-kit、SCF阳性细胞的平均光密度值(average optical den-sity,AOD)。
取大鼠结肠组织样品，加入蛋白裂解液混匀，冰上静置10～15min，12000rpm离心10min，取上清液，重复离心，BCA蛋白测定试剂盒测得待测样品的蛋白浓度。进行SDS-PAGE电泳，转膜，PVDF膜取出置于含5%奶粉的TBST中，室温慢摇封闭1h，一抗（1:1000稀释的兔抗鼠c-kit或1:1000稀释的兔抗鼠SCF）放置低速摇床上4℃过夜。TBST漂洗3次，10min/次，室温孵育辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（1:3000稀释的羊抗兔IgG）低速孵育1h，TBST漂洗3次，10min/次。ECL工作液浸润PVDF膜，避光显影，Tubulin作为内参照。
取液氮冻存新鲜结肠组织，提取总RNA，测定RNA浓度，RNA电泳测定其完整性。经promega反转录试剂盒操作，所得cDNA进行RT-PCR检测。反应体系共10μL。经ABI Primer Express10软件设计荧光定量PCR引物，由大连宝生物工程有限公司合成。各检测指标引物序列见
实验过程中，无大鼠死亡，表明复方地芬诺酯法制备FC模型具有安全性、稳定性。模型组、麻仁丸组及肠润方高中低各剂量组在大鼠首粒黑便排出时间、6h内粪便排出颗粒数量以及粪便重量与空白组比较均有统计学差异（P＜0.05），表明FC大鼠模型成功复制。见
注： 与空白组比较
c-kit、SCF均分布于结肠组织和间隙。从c-kit的表达情况分析，结果显示：与空白组比较，模型组和肠润方低剂量组的c-kit表达量均显著降低（P＜0.01或P＜0.05），肠润方高剂量组和中剂量组与空白组比较无显著差异（P>0.05），而麻仁丸组的c-kit表达量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，麻仁丸组、肠润方高剂量组和中剂量组的c-kit表达量均显著升高（P＜0.01或P＜0.05），而肠润方低剂量组与模型组比较无显著差异（P>0.05）。其中，肠润方高、中、低剂量组的c-kit表达量呈逐渐下降的趋势。见图1。
从SCF的表达情况分析，结果显示：与空白组比较，模型组和肠润方中剂量组和低剂量组的SCF表达量均显著降低（P＜0.001或P＜0.01），而麻仁丸组和肠润方高剂量组与空白组比较无显著差异（P>0.05）；与模型组比较，麻仁丸组、肠润方高剂量组和中剂量组的SCF表达量均显著升高（P＜0.01或P＜0.05），而肠润方低剂量组与模型组比较无显著差异（P>0.05）。其中，肠润方高、中、低剂量组的SCF表达量呈逐渐下降的趋势。见
图2 免疫组化检测各组大鼠结肠中SCF分布与表达情况（SP×400）
注： 与Control组比较
与空白组比，模型组、麻仁丸组、肠润方低剂量组c-kit表达显著降低（P＜0.001或P＜0.01），中、高剂量组无显著差异（P>0.05）；与模型组比，麻仁丸组及肠润方高、中剂量组c-kit表达显著升高（P＜0.001），肠润方低剂量组无显著差异（P>0.05）。见图
图3 western blot检测大鼠结肠组织c-kit、SCF的蛋白水平
注： 与Control组比较
与空白组比，模型组、麻仁丸组、肠润方中、低剂量组SCF表达显著降低（P＜0.001或P＜0.01），高剂量组无显著差异（P>0.05）；与模型组比，麻仁丸组、肠润方高、中剂量组SCF表达显著升高（P＜0.001），低剂量组无显著差异（P>0.05）。见图
与空白组比，模型组、麻仁丸组、肠润方中、低剂量组c-kit mRNA表达显著降低（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05），高剂量组无明显差异（P>0.05）；与模型组相比，麻仁丸组、肠润方高剂量组、中剂量组中c-kit表达显著升高（P＜0.001或P＜0.05），低剂量组无显著差异（P>0.05）。见
图4 RT-PCR检测大鼠结肠组织c-kit、SCF mRNA表达水平
注： 与Control组比较
与空白组相比，模型组、麻仁丸组、肠润方低剂量组中SCF mRNA表达均显著降低（P＜0.001或P＜0.01），高、中剂量组无明显差异（P>0.05）；与模型组相比，麻仁丸组、肠润方高、中、低剂量组均显著升高（P＜0.001或P＜0.01或P＜0.05）。见
肠道平滑肌与心脏相同，也表现其自主的电节律性，它起源于肌间神经丛周围的起搏细胞，称为Cajal间质细胞。ICC通过自发产生的节律性慢波控制肠道收缩的节点、频次与方向，慢波由肠神经-ICC-平滑肌细胞网络间的缝隙连接传播，最终引发平滑肌的周期收
在ICC的发育、分化及表型的维持中c-kit、SCF及其组成的c-kit/SCF信号通路扮演了重要的角色。c-kit是由人染色体4q11~12的原癌基因c-kit编码的跨膜蛋白，由于其特异性表达于ICC，ICC可以通过标记c-kit抗体来识别。c-kit在胞外配体结合区与神经元表达的配体干细胞因子SCF结合，SCF发生二聚化后c-kit单体结构发生改变，产生均聚，导致细胞膜上氨基残基的自动磷酸化，启动SCF/c-kit信号通路，介导各种第二信号分子调节ICC的细胞功
中医认为正虚邪恋，缠绵不愈，正气不足是导致慢性便秘的根本原因。FC病机在于阴血不足，肠道失润，亦或是气虚气滞，推动无力，或两者兼有。治疗便秘时不应局限于通便，而应从患者自身整体状况出发，发挥中医整体把握、病症兼顾、平衡阴阳及调和气血的优势，改善便秘症状的同时减少其并发症，从而提高患者生存质量。基于上述认识，笔者提出“以补通秘”的治疗原则，其目的是通便不用泻药，通过健脾行气、滋阴润肠，促进肠道蠕动而达到标本兼治。肠润方是以“滋阴行气”为基本治法，具有滋阴益气、行气润肠的功效。肠润方治疗FC临床疗效显著，有效提高患者生存质量，近期有效率达90.0%，随访3个月有效率67.5
本研究表明，肠润方可明显提高c-kit、SCF蛋白表达及c-kit、SCF mRNA的表达水平，通过修复c-kit/SCF信号系统恢复ICC对胃肠道电节律的正常调控，达到促进肠道蠕动，恢复胃肠道动力的作用。前期研究表
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