摘要
采用MTT法测定益气活血方在不同作用时间下对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长、抑制作用；应用流式细胞技术检测其对细胞周期的影响；利用Western Blot 法检测Kif15、Cyclin B1、Cyclin D、CDK1蛋白表达的影响。
倒置显微镜下观察发现，益气活血方作用于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞48h后，细胞发生不同程度的形态学改变，细胞减少，排列疏松，体积变小，形态变圆；随着给药浓度的增加，作用时间的延长，益气活血方对细胞的抑制率相应增加，其中12.5g/L、25g/L浓度组的增殖抑制率接近阳性对照组（10nM紫杉醇）；12.5g/L剂量益气活血方作用于MDA-MB-231细胞48h后可使肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G1期; 同时，益气活血方可明显下调细胞周期相关的Kif15、Cyclin B1蛋白表达，差异有统计学意义。
三阴性乳腺癌是乳腺癌中具有高度侵袭性生物学行为的亚型，发病年龄较小，组织学分级高，较早发生局部复发或远处转
人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自中国科学院上海细胞库，用含10%胎牛血清的L15培养基培养，培养基中加入100 U/L青霉素和10 mg/mL链霉素。置于37℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中培养，次日观察细胞贴壁情况并换液。贴壁生长良好的乳腺癌细胞经0.25%胰蛋白酶消化，选用对数生长期细胞进行实验。
紫杉醇购自selleck公司（货号S1150，规格10mM/1ml），纯度99.86%，分子量853.92。
益气活血方由黄芪、莪术按1：1比例组成。方中生药均购于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院中药房，经上海中医药大学中药学院中药鉴定教研室鉴定。煎前冷水浸泡30min，武火熬开后文火煎煮30min。采用水煎醇沉法，加入乙醇沉淀48h后，取上层液体过0.22μm滤膜，调整浓度配置成5g/mL储存液，置于4℃冰箱中保存。
L-15液体培养液、胎牛血清、胰酶、磷酸盐缓冲液（PBS）均为Gibco公司产品；四甲基氮唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）及DMSO均购自上海生工生物有限公司。细胞周期检测试剂盒购置于南京凯基生物科技发展有限公司；Kif15、Cyclin B1、Cyclin D、CDK1、内参GAPDH（均为抗兔单克隆抗体）及其相应的二抗均购自美国Cell Signaling公司。
取对数生长期的MDA-MB-231细胞悬液，按照5×1
细胞增殖抑制率的计算方法：细胞增殖抑制率=（1－实验组光度吸收值OD值/对照组光度吸收值OD值）×100%。
流式细胞检测分为4组，分别为空白对照组；阳性对照组：紫杉醇的浓度为10nM；益气活血方低剂量组：浓度为3.125g/L的益气活血方中药汤液。益气活血方高剂量组：浓度为12.5g/L的益气活血方中药汤液。细胞转染后48h用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化细胞，清洗一次，以2000 r/min离心5min，离心后每组加入1×Annexin V Binding Buffer 100μL，充分混匀细胞，每组加入5μL FITC Annexin V染液，5μL PI染液，避光室温反应15min，然后每管加300μL 1×Annexin V Binding Buffer溶液，1h流式细胞仪检测。
Western Blot 检测细胞分为4组，分别为空白对照组；阳性对照组：紫杉醇的浓度为10nM；益气活血方低剂量组：浓度为3.125g/L的益气活血方中药汤液。益气活血方高剂量组：浓度为12.5g/L的益气活血方中药汤液。收集各组细胞后加入RIPA裂解液，离心取上清，BCA法测定蛋白质含量，与5×蛋白上样缓冲液混合后煮沸10min，取30μg蛋白样本经10% SDS-PAGE胶进行分里，转膜后将PVDF膜用50g /L脱脂奶粉室温封闭1h，一抗 4 ℃摇床孵育过夜，常温封闭相应二抗1h，用PBST到PBS过渡式洗涤3次，ECL法曝光显影，凝胶成像仪扫描胶片并保存结果。
倒置显微镜下见正常对照组细胞生长旺盛，多呈椭圆形或多角形，细胞体完整，胞核较大，呈卵圆形居中。浓度为12.5g/L的益气活血方作用于MDA-MB-231细胞，24h内变化不明显，48h之后，出现凋亡细胞，细胞体积缩小，形态变圆，出现细胞膜破损，细胞皱缩并脱落。72h后细胞变化最明显，凋亡细胞增多，从瓶壁脱落，出现部分细胞碎片漂浮。见
图1 12.5g/L浓度益气活血方作用于MDA-MB-231细胞不同时间的细胞形态变化
采用MTT比色法检测益气活血方作用于MDA-MB-231细胞24、48h的细胞增殖抑制率，结果显示，随着药物浓度的增加及作用时间的延长，益气活血方对细胞的抑制作用明显提高。各组增殖抑制率与空白对照组比较降低有统计学差异，其中12.5g/L、25 g/L组的增殖抑制率与10nM紫杉醇阳性对照组接近，两者差异无统计学意义。见
注： 与空白对照组比较
▲▲P<0.01
流式细胞术检测结果显示，随着药物浓度增加，G0/G1期比例增加，S期比例逐渐降低，与空白对照组相比差异有统计学意义。而G2/M期比例却无明显变化，提示益气活血方对MDA-MB-231细胞阻止在G1期。见
图2 益气活血方作用24h后MDA-MB-231细胞周期变化
注： 与空白对照组比较
临床研究发现，乳腺癌术后患者多存在正气亏虚、瘀血内停，其一是因手术对人体损害，致使正气外泄，气血受扰；其二是因为术后放疗、化疗等给人体带来的部分副反应，造成人体免疫功能低下，机体调节失衡，都是加重气虚的病理因素；而肿瘤造成的瘀血状态往往又可引起患者凝血功能异常，继而造成新的微循环障碍，加重疾病发
实验结果表明：益气活血方可抑制人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖，使其发生不同程度的形态学改变，并且抑制作用具有剂量-时间依赖性。细胞周期的动态平衡是维持细胞自身稳定的重要因素，它由细胞增殖、生长阻滞和细胞凋亡共同调节，并需要多种胞内和胞外信号的共同参
本研究中Western blot检测结果提示：益气活血方可显著下调Cyclin B1、Kif15的表达，且具有浓度依赖性。细胞周期蛋白（Cyclins）是调控细胞周期的主要成分，细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）在癌细胞中过表达，可能与激酶CDC2形成复合物，启动有丝分裂，越过细胞周期检查点，导致失控性的细胞增殖有
目前，乳腺癌发病率在全球范围内逐年增加且呈现年轻化趋势，虽然新药及临床试验层出不穷，但主要针对激素依赖性乳腺癌，而对三阴乳腺癌复发耐药及维持治疗等方面并不乐观，缺少有效既经济又耐受性良好的维持治疗药物。本研究结果初步证实益气活血方能通过调控肿瘤细胞周期抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生长。然而，本研究仅仅为益气活血法应用于治疗三阴性乳腺癌的机制探讨迈出了一小步，而中药复方的抗肿瘤作用往往多途径，其具体作用靶点有待我们深入研究。
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